發(fā)酵過程優(yōu)化與控制技術(shù)研究堵國成

江南大學(xué)

1生物質(zhì)原料化學(xué)品－精細(xì)化學(xué)品－大宗化學(xué)品－食品添加劑－生物塑料－溶劑－酚類－粘合劑－脂肪酸－碳黑、顏料－燃料、香料、墨水－洗滌劑生物能源－生物酒精－生物柴油－甲醇－氫氣－沼氣工業(yè)生物技術(shù)主要局部--發(fā)酵工程2獲得應(yīng)用價值的微生物反響器及過程放大發(fā)酵過程優(yōu)化和控制發(fā)酵工程研究發(fā)酵產(chǎn)物別離提取3發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義微生物能夠積累最大目的產(chǎn)物(產(chǎn)量)的條件是什么？高產(chǎn)量便于產(chǎn)品別離提取關(guān)鍵問題1工程意義1相關(guān)研究：微生物生理、遺傳特性和營養(yǎng)、環(huán)境因素4底物最多被微生物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(轉(zhuǎn)化率)的條件是什么？糧食原料為底物高轉(zhuǎn)化率降低原料本錢關(guān)鍵問題2工程意義2相關(guān)研究：微生物代謝途徑和過程條件發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義5微生物最快速度發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物的條件是什么？分批操作為主高生產(chǎn)強度縮短生產(chǎn)周期工程意義3關(guān)鍵問題3相關(guān)：微生物反響動力學(xué)和系統(tǒng)優(yōu)化發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義6條件確定過程優(yōu)化初始條件過程分析過程強化發(fā)酵優(yōu)化的研究思想：發(fā)酵是一個過程7基于細(xì)胞表觀特性進行優(yōu)化0

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(Pyruvate)/(g/L)

C

基于細(xì)胞內(nèi)局部析進行優(yōu)化高產(chǎn)量高底物轉(zhuǎn)化率高生產(chǎn)強度優(yōu)化策略在理論和技術(shù)上有突破，在工業(yè)生產(chǎn)中能廣泛應(yīng)用顯著提高發(fā)酵過程的經(jīng)濟性和科學(xué)性研究方法81基于微生物反響原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù)優(yōu)化微生物生長的物理和化學(xué)環(huán)境保證微生物生長處于最適條件根本思想奠定根底基于底物運輸、生化反響、產(chǎn)物排出確定不同環(huán)境條件對微生物生長和代謝產(chǎn)物分布的影響Prod.Distribution發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)9●培養(yǎng)基組成的優(yōu)化技術(shù)●發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化技術(shù)

●確定培養(yǎng)基組分的最小用量，防止底物的過量或缺乏●減少副產(chǎn)物的形成，使底物轉(zhuǎn)化率明顯提高●對關(guān)鍵物質(zhì)的濃度及其供給方式進行優(yōu)化，使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量明顯提高●分析不同環(huán)境條件下微生物的生理學(xué)目的

內(nèi)容102基于微生物代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù)研究思想控制環(huán)境條件在最適合細(xì)胞生長或最適合產(chǎn)物合成的水平目的分析不同T、pH、RPM、DO發(fā)酵過程的動力學(xué)參數(shù)(μ，qp，qs)流變學(xué)參數(shù)的變化特性分階段控制策略提出分階段T、pH、RPM、DO發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)113基于反響動力學(xué)和人工智能的優(yōu)化和控制技術(shù)研究思想建立動力學(xué)模型，求解參數(shù)并評價其適用性對發(fā)酵進程和產(chǎn)量指標(biāo)進行預(yù)測ModelFormMonodConstantyieldu=umax

s/(Km+s)Yx/s=Y0SubstrateinhibitionConstantyieldu=umax

s/(Km+s+s2/Ki)Yx/s=Y0SubstrateinhibitionVariableyieldu=umax

s(1-–

T.s)/(Km+s+s2/Ki)Yx/s=Y0(1-–T.s)/(1+R.s+G.s2)SubstrateandproductinhibitionInhibitionsConstantsyieldsu=umax

s/(Km+s+s2/Ki)u=umax

o(1-–P/Pm)qp=alpha.u+betaalpha,betaandYp/s以數(shù)學(xué)模型為根底的優(yōu)化優(yōu)化發(fā)酵過程發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)12

以生理模型為根底的優(yōu)化采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、專家系統(tǒng)、模糊邏輯控制技術(shù)對發(fā)酵過程進行在線狀態(tài)預(yù)測和模式識別自適應(yīng)最優(yōu)化控制系統(tǒng)的開發(fā)、計算機模擬和實際應(yīng)用134基于代謝通量分析的過程優(yōu)化技術(shù)研究思想?yún)⒖家阎纳磻?yīng)計量關(guān)系、代謝途徑、生理、特征，構(gòu)建、合成不同產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)。利用代謝通量分析方法，計算得出胞內(nèi)各條代謝途徑的通量變化。發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)14分析不同發(fā)酵產(chǎn)品合成途徑中主要代謝節(jié)點的性質(zhì)，結(jié)合發(fā)酵過程中胞內(nèi)能量代謝情況，提出一系列發(fā)酵優(yōu)化策略。目的15長期脅迫－可遺傳性的應(yīng)答〔遺傳變異〕短期脅迫－不可遺傳性的應(yīng)答〔生理性的)PyruvateNAD+NADHADPATPethanolAnaerobicAerobicMitochondrionATP環(huán)境壓力或脅迫饑餓、高溫、高壓、機械剪切、冷凍、強酸、強堿、高滲透壓〔高鹽〕、活性氧、有毒化學(xué)物質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的臨時改變，酶原的激活以及代謝途徑的臨時調(diào)整等5基于環(huán)境脅迫條件下微生物生理應(yīng)答的過程優(yōu)化技術(shù)發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)16研究一些重要的工業(yè)微生物的抗脅迫因子及其抗脅迫機制，考察環(huán)境脅迫條件下特定微生物蛋白轉(zhuǎn)錄和代謝途徑變化，采用不同環(huán)境脅迫手段或措施對微生物的生長或代謝進行調(diào)控，促進微生物生長或大量合成目的產(chǎn)物。

學(xué)術(shù)思想17學(xué)術(shù)思想6基于微生物代謝的輔因子調(diào)控的過程優(yōu)化技術(shù)CofactorsMetalionsNADH/NAD+NADPH/NADP+ATP/ADP/AMPCoA/Acetyl-CoAVitamins研究輔因子形式及其濃度在物質(zhì)代謝和信號傳遞途徑中控制代謝流方向和流量分配的作用機制、物質(zhì)流和輔因子流的變化規(guī)律，對微生物的生長或代謝進行調(diào)控，促進微生物合成目的產(chǎn)物的代謝流的最大化和快速化。發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)18發(fā)酵過程優(yōu)化與控制技術(shù)研究舉例19舉例1：丙酮酸發(fā)酵GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1,NA)PDC(B1)PT(B6)PC(Bio)B1：硫胺素NA：煙酸Bio：生物素B6：吡哆醛GlucosePyruvate光滑球擬酵母中丙酮酸代謝途徑如何得到丙酮酸高產(chǎn)量發(fā)酵？--菌株選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化XXXX選育自身不能合成維生素的酵母(維生素缺陷型)控制培養(yǎng)基中維生素濃度20t

0.4

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動力學(xué)分析高溶氧下，丙酮酸轉(zhuǎn)化率較高，但生產(chǎn)強度(葡萄糖消耗速度)較低低溶氧下，葡萄糖消耗速度加快，然而丙酮酸產(chǎn)率卻明顯下降代謝網(wǎng)絡(luò)分析DO=10%DO=85%PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸進一步代謝的通量下降了63.3%高溶氧下轉(zhuǎn)化率高的原因如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度？--分階段溶氧控制輔因子分析總ATP下降31.4%,NADH下降18.6%生產(chǎn)強度(葡萄糖消耗速度)59％低溶氧生產(chǎn)強度高的原因DO=10%DO=85%21高產(chǎn)量(89.4g/L)高產(chǎn)率(0.636g/g)高生產(chǎn)強度(1.95g/(Lh))確定分階段供氧模式:發(fā)酵0-16h控制kLa為450h-1，16h后將kLa降低至200h-1碳平衡分析前16h較高溶氧有利于碳流合成細(xì)胞；采用單一高或低供氧模式，不能同時到達高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強度！16h后耗氧速率恒定，碳流轉(zhuǎn)向合成丙酮酸結(jié)果如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度?--分階段溶氧控制分階段溶氧控制！如何分階段？22舉例2：維生素C發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控我國是世界最大的維生素C生產(chǎn)國和出口國，2021年生產(chǎn)10萬噸左右，產(chǎn)值45億，占世界市場90％小菌(氧化葡萄糖桿菌G.oxydans)大菌(巨大芽孢桿菌B.megaterium)關(guān)鍵科學(xué)問題：維生素C發(fā)酵微生物的功能關(guān)系L-山梨糖2-酮基-L-古龍酸現(xiàn)況：維生素C兩步發(fā)酵工藝小菌單獨培養(yǎng)生長、產(chǎn)酸困難大菌本身不產(chǎn)酸，促進小菌生長和產(chǎn)酸團隊承擔(dān)的國家863重點工程和國家支撐工程與南開大學(xué)功能基因組學(xué)中心、國內(nèi)最大Vc生產(chǎn)企業(yè)合作實現(xiàn)組學(xué)技術(shù)解決發(fā)酵工業(yè)長期問題的典型+23基因組測序步驟鳥槍法測序提取基因組DNA打斷基因組DNA基因文庫構(gòu)建大規(guī)模測序羅氏GSFLX高通量基因組測序銜接子連接單鏈DNA與磁珠結(jié)合油滴中PCR反響序列拼接測序反響填補缺口基因組注釋代謝途徑分析小菌測序大菌測序代謝途徑分析代謝途徑分析從代謝途徑角度解析兩菌關(guān)系24氧化葡萄糖酸桿菌中心代謝途徑分析缺失編碼琥珀酸鹽脫氫酶的基因，檸檬酸循環(huán)不完全無編碼磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不能通過糖異生生產(chǎn)C6G.oxydans基因組含編碼氧化戊糖磷酸途徑和D途徑的全部酶基因缺失編碼磷酸果糖激酶的基因，糖酵解途徑不完全25蛋白質(zhì)組學(xué)小菌單獨發(fā)酵時胞內(nèi)蛋白表達大菌存在時小菌胞內(nèi)蛋白表達功能蛋白確定，研究大菌影響小菌產(chǎn)酸的機制K.VulgarB.megaterium26發(fā)酵優(yōu)化明確大菌調(diào)控小菌的作用方式闡釋大小菌之間的功能關(guān)系發(fā)展調(diào)控小菌生理功能的策略提高糖酸轉(zhuǎn)化率提高VC產(chǎn)量提高生產(chǎn)強度基因測序功能蛋白產(chǎn)物解析3-磷酸甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循環(huán)大菌特定的代謝途徑L-山梨酮2-酮基-L-古龍酸L-山梨糖2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)途徑Vc目標(biāo)1：確定微生物之間的功能關(guān)系，提高效能目標(biāo)2：構(gòu)建Vc一步發(fā)酵菌株，實現(xiàn)重大創(chuàng)新舉例2：維生素C發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控27舉例3：透明質(zhì)酸(HA)發(fā)酵過程優(yōu)化與控制透明質(zhì)酸三級結(jié)構(gòu)優(yōu)良理化性質(zhì)：粘彈性高保濕性生物相容性食品添加劑關(guān)節(jié)炎治療化裝美容高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸乳酸對細(xì)胞生長和HA合成有著較強的抑制作用細(xì)胞生長和HA合成之間存在對碳源和關(guān)鍵輔因子的競爭HA發(fā)酵存在問題28透明質(zhì)酸發(fā)酵過程的混合與傳質(zhì)特性優(yōu)化研究問題高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸溶氧水平表觀黏度有效攪拌區(qū)域模型有效攪拌區(qū)域控制模型的混合與傳質(zhì)動力學(xué)(Va=1〕剪切力對菌體形態(tài)影響理想HA發(fā)酵模式：低剪切、高傳質(zhì)、高溶氧溶氧水平溶氧傳遞系數(shù)表觀粘度攪拌轉(zhuǎn)速29降解透明質(zhì)酸提高發(fā)酵過程的混合及傳質(zhì)效率問題高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸氧化復(fù)原降解HA提高混合與傳質(zhì)效率FT-IR分析結(jié)果過氧化氫/抗壞血酸氧化復(fù)原降解HA氧化復(fù)原降解HA沒有破壞其根本結(jié)構(gòu)單元HA氧化復(fù)原降解對HA發(fā)酵的影響添加H2O2/抗壞血酸對流體力學(xué)影響添加H2O2,Vc30Transglutaminase

(TGase,Proteinglutamineγ-glutamyltransferase,EC2.3.2.13)舉例4：Transglutaminase:ActivationMechanismandFermentationOptimization

通過Nε-(γ-谷酰胺)賴氨酸鍵交聯(lián)蛋白質(zhì)催化蛋白質(zhì)中Gln的γ-羧酰胺基與伯胺間發(fā)生轉(zhuǎn)移反響蛋白質(zhì)脫酰胺作用通過形成脂鍵共價連接蛋白質(zhì)和脂肪酸的長鏈ω-羥基目前唯一商業(yè)化并大規(guī)模生產(chǎn)的可在蛋白質(zhì)間形成共價交聯(lián)的酶制劑31ActivationMechanismofTransglutaminasePre-Pro-TGaseSecretedfromcellsfoldingPro-TGaseInhibitor(TAPI)InhibitionProtease-inhibitorcomplexsactivationSerineProteaseMetalloProteaseTGasePro-region(AAs)+舉例4：Transglutaminase:ActivationMechanismandFermentationOptimization32根據(jù)該TG