高效液相色譜分析演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)（優(yōu)選）高效液相色譜分析目前二頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)1.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高壓：HPlC供液壓力和進(jìn)樣壓力都很高（150～350X105Pa）。高壓是的一個(gè)突出特點(diǎn)。高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。目前三頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2.HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：流動(dòng)相的選擇：操作溫度：GC分析多用于分析氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定有機(jī)化合物（占總數(shù)的20%）；HPLC可分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定有機(jī)化合物（占80%）。GC采用的流動(dòng)相為幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用??；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合（供選擇的機(jī)會(huì)多）。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離。GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。目前四頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)第二節(jié)HPLC儀器目前五頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)目前六頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)HPLC儀器包括：高壓輸液裝置→進(jìn)樣系統(tǒng)→分離系統(tǒng)→檢測(cè)系統(tǒng)此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。梯度淋洗目前七頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)1.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：2）脫氣：3）高壓泵：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔很小約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去。要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒流型和恒壓型。4）梯度淋洗裝置：目前八頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)①往復(fù)式柱塞泵（恒流型）②氣動(dòng)放大泵（恒壓型）目前九頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)4）梯度淋洗裝置：作用是在分離過(guò)程中，按一定的程序連續(xù)改變流動(dòng)相中多種不同性質(zhì)溶劑的配比，以改變流動(dòng)相的極性、離子強(qiáng)度或酸度等，從而提高試樣的分離效率，縮短分析時(shí)間，使色譜峰形得到改善，提高測(cè)定的靈敏度和定量的準(zhǔn)確度。目前十頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2.進(jìn)樣系統(tǒng)1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但不能承受高壓、進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。目前十一頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2）高壓進(jìn)樣閥：裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。目前十二頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)3.色譜柱目前十三頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)1）要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長(zhǎng)多為15~30cm，內(nèi)徑為4~5mm；2）柱的填充：主要采用勻漿法（濕法）。填充方法：

填充時(shí)，將制作好的勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長(zhǎng)管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快（防凝聚、沉降或結(jié)塊）、且無(wú)空氣進(jìn)入（影響填充均勻性）。目前十四頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)4.檢測(cè)器1）紫外光度檢測(cè)器原理：依據(jù)被分析試樣組分對(duì)特定紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律。

紫外光度檢測(cè)器光路圖目前十五頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)1、高靈敏度，最小檢測(cè)量10-9g·mL-1；2、對(duì)流速和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫；3、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；4、不適用于對(duì)紫外完全不吸收的試樣，溶劑的選擇受限制。特點(diǎn)：目前十六頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA或DAD）目前十七頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)波長(zhǎng)可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖目前十八頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2）熒光檢測(cè)器

根據(jù)某些物質(zhì)受激后能產(chǎn)生一定強(qiáng)度熒光的性質(zhì)，可制成靈敏度極高的熒光檢測(cè)器。它是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。適合于具有對(duì)稱共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)芳環(huán)分子，如稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、維生素、色素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測(cè)定。

目前十九頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同，其中一束（通常是通過(guò)樣品+溶劑相）光因?yàn)榘l(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板3）示差折光檢測(cè)器特點(diǎn)：①為通用型濃度檢測(cè)器，靈敏度為10-7g?mL－1；②但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。目前二十頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)原理：基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)的含量。對(duì)溫度變化敏感。4）電導(dǎo)檢測(cè)器屬于電化學(xué)檢測(cè)器，主要用于離子色譜的檢測(cè)。5）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器原理：見(jiàn)書(shū)本P91特點(diǎn)：①通用型檢測(cè)器②與示差折光檢測(cè)器相比，靈敏度高③響應(yīng)信號(hào)不受溶劑和溫度的影響，可用于梯度淋洗④對(duì)幾乎所有樣品的響應(yīng)因子接近一致，因此可以在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定未知物的近似含量（fi/fs接近1）目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)第三節(jié)高效液相色譜法的類型及分離原理1、液－液分配色譜法2、液－固色譜法3、離子交換色譜法4、離子色譜法5、離子對(duì)色譜法6、空間排阻色譜法目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)一、液－液分配色譜原理

根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程。目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2.流動(dòng)相根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜和反相分配色譜。正相分配色譜：流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離。反相分配色譜：流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離。目前二十四頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)3.固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：,’-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鯊?fù)椋⊿Q）。早期通過(guò)在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相（通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)

）。目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)二、液－固吸附色譜是基于各組分在固體吸附劑表面上具有不同吸附能力而進(jìn)行分離。以固體吸附劑為固定相，如極性的硅膠、氧化鋁、分子篩和非極性的活性炭等（較常使用5－10nm硅膠微粒）。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。宜于分離極性不同或含極性基團(tuán)相同但數(shù)目不同的試樣，也適于分離異構(gòu)體，但不宜于分離同系物。

目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)三、離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測(cè)定各類陰、陽(yáng)離子的分離分析方法。它既適于無(wú)機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1.

原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2.固定相按離子交換劑類型分四種：目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆按固定相制作方法可分為：

多孔型離子交換樹(shù)脂(包括微孔型和大孔型)；

表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹(shù)脂；

離子交換鍵合型。目前三十頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)3.流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的鹽類緩沖溶液（有一定pH和離子強(qiáng)度），通過(guò)改變pH、緩沖劑類型、離子強(qiáng)度、加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來(lái)控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進(jìn)而影響樣品待測(cè)物的分離。目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)四、離子色譜（IC）

以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象。目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)原理:采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；在分離柱后，用另外一支抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電流;采用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)流出組分。快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混合物;各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)例如：分析陽(yáng)離子時(shí)，以無(wú)機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+HCl(流動(dòng)相)——R+—Cl-+H2O

R+—OH+MCl(待測(cè)物)——R+—Cl+M+OH-可見(jiàn)，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)特點(diǎn)：分析速度快：可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；分離能力高：在適宜的條件下，可使常見(jiàn)的各種陰離子混合物分離；

分離混合陰離子（NO3—、NO2－、SO42－、PO43－等）惟一快速、靈敏、準(zhǔn)確的最有效分析方法。缺點(diǎn)：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過(guò)抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)五、離子對(duì)色譜法（IPC）主要用來(lái)分離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。原理：將與待測(cè)物離子A電荷相反的離子B（稱為對(duì)離子或反離子）加入到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子與對(duì)離子形成疏水型離子對(duì)AB，該AB離子對(duì)的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測(cè)離子的保留特性。陰離子分離的對(duì)離子：烷基銨類陽(yáng)離子分離的對(duì)離子：烷基磺酸類目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)六、尺寸排阻色譜法又稱凝膠（滲透）色譜，主要用于大分子的分子分離。它是基于待測(cè)物分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。1、分離原理：固定相為化學(xué)惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，分子體積大的待測(cè)物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測(cè)物分子按分子大小（分子量大?。┫群髲闹辛鞒觥Ｄ壳叭唔?yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2.固定相3.流動(dòng)相的要求：能溶解樣品且與凝膠相似（潤(rùn)濕凝膠）、粘度小（增加擴(kuò)散速度）。

目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)七、親合色譜主要用于生物大分子與固定相之間的特異親合力進(jìn)行選擇性分離及純化的方法。特點(diǎn)：選擇性過(guò)濾、純化效果好。目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)第四節(jié)色譜分離方法的選擇一般可根據(jù)試樣相對(duì)分子質(zhì)量范圍、溶解度及分子結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分離方法的初步選擇。一、根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇二、根據(jù)溶解性選擇三、根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇目前四十頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)第五節(jié)高效毛細(xì)管電泳簡(jiǎn)介一、基本原理1、概述在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實(shí)現(xiàn)分離。目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)

毛細(xì)管電泳是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)試樣中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離、分析物質(zhì)的一類液相技術(shù)，是經(jīng)典電泳和現(xiàn)代微柱分離的結(jié)合。目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)2、電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象電泳現(xiàn)象：帶電離子在電場(chǎng)作用下的遷移（定向移動(dòng)），速度ν電泳目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)電滲流現(xiàn)象：石英玻璃表面存在硅羥基，pH>3時(shí),形成雙電層，在高電場(chǎng)的作用下，雙電層中的水合陽(yáng)離子引起毛細(xì)管中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度ν電滲流目前四十五頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)3、分離過(guò)程：目前四十六頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)4、分離類型

毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）：最普遍、最基本的一種分離模式。目前四十七頁(yè)\總數(shù)五十四頁(yè)\編于十三點(diǎn)毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）：將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩