免疫學檢測技術的基本原理及其應用第一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五提要免疫學檢測技術主要應用：對多種免疫性疾病的診斷、療效評估、發(fā)病機制探討;對抗原性物質、免疫細胞、細胞因子、粘附分子或細胞受體等的定性、定量檢測。第二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)抗原或抗體的檢測抗原-抗體反應包括：沉淀反應、凝集反應、溶解反應、補體結合反應、中和反應等?？乖?抗體反應可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原；也可用已知的抗原檢測未知的抗體。第三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)抗原或抗體的檢測免疫標記技術包括：免疫酶技術、免疫熒光技術、同位素標記技術、化學發(fā)光免疫技術、免疫膠體金技術等。第四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五抗原-抗體反應的特點：P226抗原-抗體的特異性結合?？乖贵w分子表面的非共價鍵結合。反應的兩個階段：特異性結合階段；可見的反應階段。是否呈現可見的反應現象，與抗原和抗體兩者的分子濃度和比例密切相關。第五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五抗原抗體比例對反應現象的影響第六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五抗原-抗體反應的影響因素1.電解質：抗原-抗體反應通常應用0.85%的氯化鈉（適當濃度的電解質）作為稀釋液。2.溫度：反應常在37℃水浴或孵育箱中進行。3.酸堿度：抗原-抗體反應適應的酸堿度

為PH6-8?？乖?抗體反應受多種因素影響第七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五抗原抗體的檢測方法凝集反應沉淀反應中和反應用標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應第八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五凝集反應

(Agglutination)

細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合、凝集的現象。1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應的抗體直接反應，出現細菌凝集或紅細胞凝集現象。又分為玻片法（定性試驗）和試管法（半定量試驗）。第九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五凝集反應

(Agglutination)2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，形成致敏顆粒，與相應抗體反應出現的顆粒凝集現象。第十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五血球凝集第十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五沉淀反應

（Precipitation)

血清蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應抗體結合后出現沉淀物，稱為沉淀反應。第十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五沉淀反應

（Precipitation)沉淀反應可在液體中進行，如絮狀沉淀。大多數沉淀反應是用半固體瓊脂凝膠為介質，進行瓊脂擴散故也稱免疫擴散。第十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五單向免疫擴散

(SingleImmunodiffusion)將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板；打孔，將抗原加入孔中擴散?？乖c抗體相遇，形成沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比。常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五雙向免疫擴散

（DoubleImmunodiffusion)將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由擴散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，可出現兩條以上的沉淀線。常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關性分析的檢測。第十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)將待測血清標本作瓊脂凝膠電泳，不同分子量蛋白組分開，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應的抗血清，與不同區(qū)帶的蛋白抗原作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應的位置形成沉淀弧。常用于血清蛋白種類分析。第十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五火箭電泳（RocketElectrophoresis)

也稱免疫擴散，是把單向免疫擴散同電泳結合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。特點：需時較短，用于快速沉淀標本中抗原含量的測定。第十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五火箭電泳示意圖第十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五免疫標記技術

用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應。能極大地提高了反應的靈敏度，可以對微量物質進行定量、定性或定位檢測。三種基本類型：免疫熒光技術、免疫酶技術和同位素標記技術。第十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五免疫熒光顯微技術

(ImmunofluorescenceTechnique)

將熒光素（異硫氰酸熒光素，FITC、藻紅蛋白，PE)與抗體連接成熒光抗體，再與待測標本的抗原反應，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復合物散發(fā)出熒光，對標本中抗原的鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補體法。第二十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五直接熒光法：將熒光素直接標記抗體作標本染色。優(yōu)點：是特異性強。缺點：每檢測一種抗原必須制備相應的熒光抗體。間接熒光法：用一抗與標本中的抗原結合，再用熒光素標記的二抗染色。優(yōu)點：敏感性比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢測。第二十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五補體結合免疫熒光法：在間接法的第一步抗原-抗體反應時加入補體，使之與抗原-抗體復合物結合；再用熒光素標記的抗C3抗體進行示蹤。第二十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五間接免疫熒光法示意圖第二十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五免疫熒光顯微技術第二十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五流式細胞術（FlowCytometry,FCM)

FCM是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數（如DNA、RNA、蛋白質和細胞體積等）進行多信息分析。流式細胞術第二十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五流式細胞儀工作原理第二十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五酶免疫測定

(EnzymeImmunoassay,EIA)用酶（常用辣根過氧化物酶，即HRP或堿性磷酸酶，即ALP)標記的抗體與相應抗原反應。通過酶作用于底物后顯色來判定結果。常用的方法有酶聯免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者測定可溶性抗原或抗體，后者測定組織中或細胞表面的抗原。第二十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五酶聯免疫吸附試驗

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法等。第二十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

ELISA檢測抗體第二十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五放射免疫測定法

(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素標記抗原進行的免疫學檢測技術。放射性核素顯示的高靈敏性，使檢測的敏感性達pg水平。常用于標記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質的測定。第三十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五免疫印跡法（Immunoblotting）將凝膠電泳與固相免疫測定結合，先把電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術測定。能分離分子大小不同的蛋白質并確定其分子量。常用于檢測多種病毒（如HIV）的抗體或抗原。第三十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五免疫印跡法示意圖第三十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)免疫細胞的檢測

檢測各種淋巴細胞的數量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結等作為標本進行檢查。第三十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上第三十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五T細胞功能測定體外法：T細胞增殖試驗形態(tài)學檢查

3H-TdR摻入法

MTT法體內法：用生物抗原或化學抗原作皮內試驗。OT-PPD皮試

第三十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細胞增殖試驗（3H-TdR摻入法）示意圖第三十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時細胞毒試驗（51Cr釋放法）示意圖：（Na51CrO4標記靶細胞）第三十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五細胞毒試驗（乳酸脫氫酶釋放法）

正常情況下，乳酸脫氫酶（LDH）存在于細胞內，細胞損傷時，細胞膜通透性增加，LDH釋放，酶促顯色反應。第三十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五酶聯免疫斑點法

（Enzyme-LinkedImmunospot,ELISPOT)在ELISA的基礎上建立的檢測抗體生成細胞及細胞因子產生細胞的方法。第四十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五CK抗體包被的反應板

CK抗原包被的反應板加入淋巴細胞加入酶標記二抗加入