檢驗科甲流實驗室檢測流程演講人：日期:目錄CATALOGUE02樣本前處理03核酸提取04RT-PCR檢測05結(jié)果解讀與報告06質(zhì)量控制與安全01樣本接收與登記01樣本接收與登記PART樣本接收標準樣本類型要求僅接收符合標準的鼻咽拭子、咽拭子或肺泡灌洗液樣本，樣本量需達到規(guī)定的最低體積要求，確保檢測靈敏度。運輸條件核查樣本必須在低溫（2-8℃）或冷凍（-70℃以下）條件下運輸，并附有完整的冷鏈運輸記錄，否則視為無效樣本。接收時需確認樣本容器無破損、標簽清晰可辨，且密封性良好，防止污染或泄漏風險。樣本完整性檢查雙人核對機制樣本接收時需由兩名工作人員同步核對患者信息、樣本類型及數(shù)量，確保與申請單一致，避免人為錄入錯誤。唯一編號生成電子化存檔登記與編號流程采用實驗室信息管理系統(tǒng)（LIMS）自動生成條形碼編號，編號需包含樣本類型標識及檢測批次信息，便于全程追溯。所有樣本信息需實時錄入系統(tǒng)，包括接收時間、交接人員、樣本狀態(tài)等，并同步備份至云端服務(wù)器，確保數(shù)據(jù)安全。若樣本需在24小時內(nèi)檢測，應(yīng)置于2-8℃專用冰箱保存，避免反復凍融影響病毒核酸穩(wěn)定性。短期保存規(guī)范需長期保存的樣本須轉(zhuǎn)移至-70℃超低溫冰箱，并分裝至凍存管中，標注編號及保存日期，定期檢查冰箱溫度記錄。長期保存要求保存區(qū)域需符合生物安全二級（BSL-2）標準，配備雙鎖管理及監(jiān)控系統(tǒng)，僅授權(quán)人員可接觸樣本。生物安全管控樣本保存條件02樣本前處理PART樣本離心要求離心速度與時間控制樣本需在3000rpm條件下離心10分鐘，確保充分分離血清與血細胞，避免細胞碎片干擾后續(xù)檢測。離心前需平衡樣本管重量，防止離心機轉(zhuǎn)子失衡。離心管規(guī)格選擇使用無菌無酶離心管，容量需與樣本體積匹配（如5mL樣本需選用15mL離心管），避免樣本溢出或離心效率不足。離心溫度要求離心過程應(yīng)在4℃低溫環(huán)境下進行，以保持病毒核酸穩(wěn)定性。若常溫離心，需在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)核酸提取步驟，防止RNA降解。病毒滅活操作滅活劑選擇與比例采用含1%TritonX-100的裂解緩沖液，按1:1體積比與樣本混合，充分渦旋震蕩30秒，確保病毒包膜結(jié)構(gòu)完全破壞。滅活后需靜置5分鐘以保證效果。滅活環(huán)境安全防護滅活效果驗證操作需在生物安全柜內(nèi)進行，實驗人員穿戴防護服、N95口罩及雙層手套。滅活后樣本需標注“已滅活”標簽，避免交叉污染。通過陰性對照樣本檢測滅活后殘留活性，確保無假陽性風險。每批次滅活操作需記錄試劑批號及操作時間備查。123裂解液添加步驟裂解后離心處理以12000rpm離心2分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新管，避免攜帶沉淀中雜質(zhì)。上清液若渾濁需重復離心，直至澄清透明。裂解時間控制混合液需在室溫靜置10分鐘，使病毒核酸充分釋放至液相。若樣本粘稠度高，可延長至15分鐘并間歇性輕彈管壁助溶。裂解液添加順序先加入200μL裂解液至1.5mLEP管，再緩慢加入200μL滅活樣本，避免直接沖擊管底沉淀物。添加后立即渦旋混勻15秒，形成均一溶液。03核酸提取PART提取試劑選擇磁珠法試劑盒采用磁性微球吸附核酸技術(shù)，具有高純度、高回收率的特點，適用于高通量樣本處理，能有效去除蛋白質(zhì)、多糖等干擾物質(zhì)。離心柱法試劑盒通過硅膠膜選擇性結(jié)合核酸，操作簡便且成本較低，適合中小型實驗室，但對復雜樣本（如痰液）的提取效率可能受限?；瘜W裂解法試劑基于酚-氯仿抽提原理，適用于病毒RNA的粗提，需配合后續(xù)純化步驟，適用于科研場景但對操作人員技術(shù)要求較高。自動化提取流程樣本前處理自動化儀器自動完成樣本裂解、混勻及轉(zhuǎn)移，減少人工操作誤差，支持批量處理（如96孔板模式），顯著提升實驗室效率。01核酸結(jié)合與洗滌儀器精準控制磁珠吸附、洗滌緩沖液用量及孵育時間，確保核酸與雜質(zhì)分離，避免交叉污染。02洗脫與收集優(yōu)化洗脫液體積（通常為50-100μL），自動分裝至預置PCR管，兼容下游擴增檢測，全程封閉式操作降低氣溶膠風險。03紫外分光光度法使用RNA特異性染料（如Qubit試劑），高靈敏度測定低濃度核酸，避免其他成分干擾，適合微量樣本質(zhì)量驗證。熒光定量法電泳分析通過瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA條帶完整性（如28S/18SrRNA比例），判斷提取過程中是否發(fā)生降解，但耗時較長且需手動操作。通過A260/A280比值（1.8-2.0為合格）評估核酸純度，檢測蛋白質(zhì)或酚類殘留，但無法區(qū)分完整性與降解程度。核酸質(zhì)量檢測04RT-PCR檢測PARTPCR反應(yīng)體系需包含逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs、特異性引物、熒光探針及緩沖液等關(guān)鍵組分，各組分濃度需嚴格校準以確保擴增效率。緩沖液中的Mg2?濃度需優(yōu)化（通常為1.5-2.5mM），以維持酶活性并避免非特異性擴增。PCR反應(yīng)體系配置反應(yīng)組分精確配制提取的RNA需通過核酸定量儀檢測濃度（A260/A280比值1.8-2.0），并通過電泳驗證完整性。若檢測降解RNA（28S/18SrRNA比值<1.0）需重新采樣，避免假陰性結(jié)果。RNA模板質(zhì)量控制配置過程需在超凈工作臺內(nèi)進行，使用無RNase耗材，并設(shè)置陰性對照（無模板對照）和陽性對照（已知濃度標準品）監(jiān)控交叉污染及試劑有效性。防污染措施擴增程序參數(shù)設(shè)置熱循環(huán)參數(shù)設(shè)計PCR階段采用三步法循環(huán)（預變性95°C30秒→退火55-60°C30秒→延伸72°C30秒），循環(huán)數(shù)通常為40-45次。對低豐度靶標可增加至50循環(huán)，但需注意平臺期信號衰減。熔解曲線分析擴增結(jié)束后執(zhí)行95°C15秒→60°C1分鐘→95°C15秒的熔解程序，通過熒光變化率（-dF/dT）判定產(chǎn)物特異性，排除引物二聚體干擾。逆轉(zhuǎn)錄條件優(yōu)化首輪反應(yīng)需設(shè)置25°C10分鐘（引物退火）、50°C30分鐘（cDNA合成）、85°C5分鐘（酶失活）三步程序。針對高GC含量模板可提高至55°C以增強逆轉(zhuǎn)錄效率。030201熒光信號讀取03數(shù)據(jù)分析標準化使用ΔΔCt法計算相對表達量，或通過標準曲線（10?-101拷貝數(shù)/μL梯度稀釋）進行絕對定量，R2值需>0.98方符合線性要求。02多通道熒光校正對FAM（報告基因）、HEX/VIC（內(nèi)參基因）等熒光通道進行光譜補償校準，避免信號串擾。內(nèi)參基因（如RNaseP）ΔCt值偏差>2需判定樣本提取失敗。01閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）判定采用儀器軟件自動設(shè)定基線（3-15循環(huán)）和閾值線（高于基線10倍標準差），Ct值<38視為陽性。弱陽性樣本（Ct35-38）需重復檢測確認。05結(jié)果解讀與報告PARTCt值范圍定義Ct值（循環(huán)閾值）是實時熒光定量PCR檢測的核心指標，反映病毒核酸擴增達到設(shè)定熒光閾值所需的循環(huán)次數(shù)。通常Ct值越低，病毒載量越高，需結(jié)合實驗室內(nèi)部標準曲線進行定量分析。臨床意義分層Ct值＜30提示高病毒載量，可能與急性感染期強相關(guān)；Ct值30-35需結(jié)合臨床癥狀判斷；Ct值＞35可能為低載量感染或殘留核酸片段，建議復測或補充其他檢測方法驗證。質(zhì)控要求每次檢測需同步運行陽性、陰性及內(nèi)標對照，確保Ct值在可接受范圍內(nèi)（內(nèi)標Ct值波動≤2個循環(huán)），排除提取或擴增環(huán)節(jié)的干擾因素。Ct值分析標準陽性判定條件靶基因（如甲流HA/NA基因）Ct值≤預設(shè)截斷值，且擴增曲線呈典型S型，內(nèi)標檢測正常。若單靶標陽性，需通過重復檢測或測序確認，避免非特異性擴增導致的假陽性。陰性判定條件靶基因未檢出（Ct值≥40或無擴增曲線），但內(nèi)標Ct值正常，表明樣本質(zhì)量合格且無抑制物干擾。若內(nèi)標異常，需重新采樣檢測?；覅^(qū)結(jié)果處理Ct值接近截斷值時（如35-40），需啟動復檢流程，結(jié)合流行病學史、臨床癥狀及平行樣本結(jié)果綜合判斷，必要時采用病毒分離或抗原檢測輔助診斷。陽性/陰性判定準則報告生成與簽發(fā)報告內(nèi)容規(guī)范報告需包含患者信息、檢測方法、靶基因名稱、Ct值、判定結(jié)果（含臨界值說明）、檢測人員及審核人員簽名，并標注“本結(jié)果僅對當前樣本負責”的免責聲明。030201分級審核制度初檢人員完成報告草擬后，由中級職稱以上人員復核數(shù)據(jù)完整性及邏輯一致性，疑難結(jié)果需提交實驗室主任進行多學科會診后簽發(fā)。信息化管理通過LIS系統(tǒng)自動關(guān)聯(lián)患者電子病歷，實現(xiàn)結(jié)果實時推送至臨床科室，同時備份原始數(shù)據(jù)（包括擴增曲線、熒光信號圖）以備溯源查詢。06質(zhì)量控制與安全PART內(nèi)部質(zhì)控樣本使用選用與待測樣本基質(zhì)匹配的質(zhì)控品，確保其穩(wěn)定性與準確性，嚴格按照說明書要求保存于指定溫度環(huán)境，避免反復凍融導致性能下降。質(zhì)控樣本選擇與保存每批次檢測前、中、后均需運行質(zhì)控樣本，記錄CT值、擴增曲線等關(guān)鍵參數(shù)，通過Levey-Jennings質(zhì)控圖分析趨勢，及時發(fā)現(xiàn)儀器或試劑異常。質(zhì)控頻次與記錄若質(zhì)控結(jié)果超出預設(shè)范圍，立即暫停檢測，排查原因（如試劑失效、儀器校準偏差、操作誤差等），必要時重新校準或更換試劑后復測。失控處理流程生物安全柜操作規(guī)范開機與氣流驗證使用前需提前運行生物安全柜至少5分鐘，確認氣流速度達標（0.38-0.51m/s）且無湍流，定期進行HEPA過濾器完整性檢測并記錄。樣本處理防護操作時穿戴雙層手套、N95口罩及護目鏡，所有開蓋、離心步驟必須在柜內(nèi)完成，避免氣溶膠外溢；樣本管開啟時保持45度角，緩慢釋放壓力。清潔與消毒每日工作結(jié)束后用75%乙醇擦拭臺面及內(nèi)壁，紫外照射30分鐘；若發(fā)生泄漏，立即用含氯消毒劑覆蓋污染區(qū)域并作用足夠時間后再清理。使用后的采血針、破