宮內(nèi)缺氧對新生大鼠神經(jīng)元的影響及當(dāng)歸的保護(hù)作用【摘要】目的探討宮內(nèi)缺氧對新生大鼠海馬神經(jīng)元的影響及當(dāng)歸注射液的保護(hù)作用。方法孕期14d的SD大鼠21只，隨機(jī)分為對照組、缺氧組和當(dāng)歸治療組。缺氧組孕鼠自孕第14天開始經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水8ml/kg，1次/d，連續(xù)7d，后用低張性缺氧模型致胚鼠宮內(nèi)缺氧2h，連續(xù)3d(孕期第14，15，16天);當(dāng)歸治療組用250g/L的當(dāng)歸注射液代替生理鹽水，其余處理同缺氧組;對照組不缺氧，其余同缺氧組。孕鼠分娩后立即取新生鼠腦，常規(guī)石蠟切片，經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuronspecificenolase，NSE)免疫組織化學(xué)染色后行像分析。結(jié)果缺氧組新生鼠海馬NSE免疫組化陽性細(xì)胞的積分光密度(IntegratedOpticalDensity，IOD)值較對照組減少〔IOD缺氧組：(±);IOD對照組：(±),〕;當(dāng)歸組新生鼠海馬NSE免疫組化陽性細(xì)胞的IOD值較缺氧組增加〔IOD治療組：(±),〕。結(jié)論一定程度的缺氧可刺激海馬CA3區(qū)神經(jīng)元變性;當(dāng)歸注射液對宮內(nèi)缺氧新生大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元可能具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】當(dāng)歸;缺氧;神經(jīng)元;免疫組化

Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofintrauterinhypoxiaonneuronofhippocampusfromnewbornratsandtheprotectiveroleofAngelicafemaleSDrats(n=21)weredividedrandomlyintothreegroups:controlgroup(CG)、hypoxiagroup(HG)andAngelicagroup(AG).SincethefourteenthdaysaftertheywerepregnanttheratsofHGwereinjectedwithnormalSalinethroughcaudalvns(within7straightdays;8ml/()beforeintrauterinhypotonichypoxia(within3straightdays;onthefourteenth、fifteenthandsixteenthdayafterpregnancy;2hourseveryday).AngelicasinensisinjectioninsteadofnormalsalinewasinjectedintotheratsintheAG,andotherprocedureswerethesameastheadministrationofhypoxiawasperformedintheouttheirbraintissuesimmediatelyofnewbornratsafterexpressionofNSEinthehippocampusofnewbornratswasstudiedwithimmunohistochemistryandtheresultswereanalyzedbyimageprocessingofNSEpositivecellsinHGwaslowerthanthatoftheCG〔IODHG：(±);IODCG：(±),〕;ButinAG,themarehigherthanthatofHG〔IODAG：(±),〕.ConclusionHypoxiacanstimulatenewbornratsneuronofCA3ofhippocampusintodegeneration,AngelicainjectioncanplayaprotectiveroletoneuronofCA3ofhippocampusfromnewbornratswithintrauterinhypoxia.

Keywords：Angelica;Hypoxia;Neuron;Immunohistochemistry

宮內(nèi)缺氧是胚胎發(fā)育中的常見癥，是造成腦癱，智力發(fā)育遲緩及智力低下的重要原因，神經(jīng)系統(tǒng)是胚胎發(fā)育中出現(xiàn)最早的系統(tǒng)之一，且神經(jīng)元又對缺氧最敏感，因此研究宮內(nèi)缺氧對神經(jīng)元的影響具有重要意義。目前國內(nèi)外缺氧對神經(jīng)元影響的研究多是在體外狀態(tài)下進(jìn)行的，在體的研究大多集中在對生后7～14d的新生鼠夾閉頸總動脈，給予低氧干預(yù)，本實(shí)驗(yàn)試圖通過建立宮內(nèi)缺氧模型，觀察在體狀態(tài)下缺氧對新生大鼠神經(jīng)元的影響，并觀察中藥當(dāng)歸對缺氧狀態(tài)的調(diào)節(jié)，為長期觀察缺氧對新生鼠的影響和治療宮內(nèi)缺氧提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1材料與儀器

材料小鼠抗NSE(CHEMICON公司);多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(棕黃色)購自武漢博士德生物工程公司。250g/L的當(dāng)歸注射液購自武漢大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科(批號060926)。

儀器OLYMPUSBx-70熒光顯微鏡成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司);德國萊卡切片機(jī);三氣培養(yǎng)箱(美國REVCO公司)。

2方法

動物配種與分組健康成年雌性SD大鼠21只(瀘州院動物中心提供)，體重220～250g，分別與一只雄鼠合籠飼養(yǎng)配種，于第2日早晨發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓記為妊娠0d，記下日期，取出雄鼠，單獨(dú)飼養(yǎng)雌鼠至孕期14d。將孕鼠隨機(jī)分為：對照組5只、缺氧組8只和治療組8只。

宮內(nèi)缺氧新生鼠模型建立缺氧組孕鼠自孕第14天開始在設(shè)置好的三氣培養(yǎng)箱(氧體積分?jǐn)?shù)130ml/L，溫度：25℃，相對濕度，75%～80%，CO2濃度體積分?jǐn)?shù)：～ml/L)內(nèi)缺氧2h/d，缺氧前1h經(jīng)尾靜脈注射2ml生理鹽水，連續(xù)缺氧3d(孕14，15，16d)，當(dāng)培養(yǎng)箱控制面板上的數(shù)值達(dá)到與設(shè)置值一致時(shí)開始記錄缺氧時(shí)間;當(dāng)歸治療組用250g/L的當(dāng)歸注射液代替生理鹽水，其余處理同缺氧組;對照組不缺氧，其余同缺氧組，孕鼠自然分娩后立即取新生鼠大腦組織，放入40g/L的多聚甲醛溶液中固定。

石蠟切片與免疫組織化學(xué)染色每組隨機(jī)選取20個(gè)新生鼠大腦，然后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)海馬冠狀切面切片(片厚4μm)，切片脫蠟至水，各切片作NSE(1∶400)免疫組化染色(常規(guī)鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法)。

學(xué)分析各組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)處理用完成，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

對照組NSE免疫組化反應(yīng)陽性細(xì)胞分布呈區(qū)域性，位于錐體細(xì)胞層，顆粒層，胞質(zhì)染為棕黃色，胞質(zhì)中央為卵圓形或圓形空泡。見圖1。

圖1對照組海馬CA3區(qū)NSE陽性細(xì)胞(↑)，IHC(SABC),400×

缺氧組NSE免疫組化反應(yīng)陽性細(xì)胞分布與對照組相似，與對照組相比缺氧組陽性細(xì)胞染色減弱，數(shù)量減少(見圖2)。其積分光密度值均減小()。見表1。

圖2缺氧組海馬CA3區(qū)NSE陽性細(xì)胞(↑)，IHC(SABC)，400×

當(dāng)歸治療組NSE免疫組化反應(yīng)陽性細(xì)胞分布與對照組相似，與缺氧組相比缺氧組陽性細(xì)胞染色增強(qiáng)，數(shù)量增多(見圖3)。其積分光密度值增大()。見表1。

圖3治療組海馬CA3區(qū)NSE陽性細(xì)胞(↑)，IHC(SABC),400×表1各組NSE免疫組化陽性細(xì)胞積分光密度(IOD)值

4討論

神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)生是相當(dāng)復(fù)雜的，也是備受人們關(guān)注的胚胎學(xué)事件。宮內(nèi)缺氧是胚胎發(fā)育中的常見癥，而海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺氧最為敏感的部位之一，因此，宮內(nèi)缺氧必然影響胚胎神經(jīng)系統(tǒng)海馬中神經(jīng)元的生長發(fā)育，由于神經(jīng)元僅能生長不能分裂，這就決定了保護(hù)神經(jīng)元，挽救受損神經(jīng)元有著重要意義。

研究常常首先要在動物體內(nèi)進(jìn)行研究，因此，動物模型的成功建立是醫(yī)學(xué)研究的重要步驟。本實(shí)驗(yàn)在本研究小組前期的宮內(nèi)缺氧模型的基礎(chǔ)上，采用了智能型三氣培養(yǎng)箱代替自制的缺氧缸而制成的持續(xù)低張性缺氧的動物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧組新生鼠神經(jīng)元的NSE免疫組化陽性細(xì)胞的積分光密度與對照組之間差異有顯著性，說明缺氧后神經(jīng)元的功能狀態(tài)發(fā)生了改變，提示該宮內(nèi)缺氧模型是基本成功的，與本實(shí)驗(yàn)組的前期方法相比，避免了氧氣、二氧化碳濃度、溫度和濕度波動對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，動物在實(shí)驗(yàn)中可自由活動，排除了情緒對實(shí)驗(yàn)的干擾。

胚胎時(shí)期神經(jīng)元主要來源于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和定向分化，而神經(jīng)干細(xì)胞的增殖受自身基因調(diào)控和外來信號調(diào)控兩種機(jī)制的影響[3～4]。經(jīng)過研究人們發(fā)現(xiàn)缺氧作為一種外來信號能誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，但卻能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。體外研究發(fā)現(xiàn)缺氧能促進(jìn)NSC的生長和生存，在體研究表明缺血缺氧能增加室下區(qū)和齒狀回內(nèi)NSC的數(shù)量，本研究小組早期研究發(fā)現(xiàn)，低氧可刺激在體胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。IwaiM研究發(fā)現(xiàn)，短暫缺血后沙土鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖始于顆粒下層，并最終分化為神經(jīng)元，海馬對缺氧非常敏感，氧濃度降低，復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)氧感受系統(tǒng)迅速感受氧分壓的變化，誘導(dǎo)適應(yīng)性機(jī)制的出現(xiàn)，以最大程度地減少低氧對腦的損傷。其中關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子是低氧誘導(dǎo)因子HIF-1，它誘導(dǎo)多種基因表達(dá)。需要指出的是，神經(jīng)系統(tǒng)對低氧最敏感，即使有HIF-1的調(diào)節(jié)，輕度低氧也可能影響神經(jīng)元功能?；虮磉_(dá)的上調(diào)將導(dǎo)致血管發(fā)生、糖酵解、細(xì)胞存活以及NSC的生長、增殖并向神經(jīng)元分化以補(bǔ)充損失的神經(jīng)元。主要機(jī)制有：①低氧時(shí)，血管內(nèi)皮生長因子，促紅細(xì)胞生成素表達(dá)增加，促使神經(jīng)干細(xì)胞克隆數(shù)及克隆中的細(xì)胞數(shù)增加;②低氧時(shí)，BMP調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖;③低氧刺激后，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)，可能有利于神經(jīng)軸突生長及建立正確的神經(jīng)通路，也可能是使神經(jīng)干細(xì)胞從增殖向分化過渡;④MAPK信號傳導(dǎo)途徑也參與神經(jīng)干細(xì)胞在低氧時(shí)增殖的調(diào)控，低氧時(shí)，JNK的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)。辛穎等研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠缺血缺氧后1d即可見變性的神經(jīng)元，3d變性的神經(jīng)元增多，5d達(dá)高峰，以紋狀體受累最重，皮質(zhì)次之，海馬各區(qū)易損順序?yàn)镃A1、CA4、CA2、CA3、齒狀回，同時(shí)GFAP強(qiáng)表達(dá)，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specificenolase，NSE)，它是糖酵解過程中催化2-磷酸甘油酸烯醇式丙酮酸的一種生物酶，特異地存在于神經(jīng)元及神經(jīng)來源的細(xì)胞中，占腦內(nèi)全部可溶性蛋白的%，細(xì)胞內(nèi)NSE的分布于免疫組化染色后在光鏡下可以看到NSE存在于正常神經(jīng)元的胞體、軸突和樹突。本實(shí)驗(yàn)我們用免疫組化方法顯示，各組新生鼠腦切片中均有NSE免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)中，觀察到缺氧3d(2h/d)組新生大鼠免疫組化NSE表達(dá)比對照組減弱、陽性細(xì)胞減少，積分光密度值減小，說明胚胎海馬的神經(jīng)元出現(xiàn)了壞死和凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少，經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞分化、補(bǔ)充，經(jīng)缺氧后7d的補(bǔ)充修復(fù)，到出生時(shí)神經(jīng)元數(shù)量仍然明顯少于對照組，但神經(jīng)元的減少究竟是由于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化減少還是神經(jīng)元的壞死或凋亡增加，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步深入研究。

當(dāng)歸是最廣泛的中藥之一。它含有阿魏酸、多種磷脂、人體必需氨基酸和微量元素等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在應(yīng)用了250g/L的當(dāng)歸注射液的缺氧的治療組新生鼠大腦NSE免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的積分光密度值較相應(yīng)缺氧組增多，而NSE又是神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，如前所述，輕度的缺氧就能影響神經(jīng)元的功能，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)缺氧后新生鼠神經(jīng)元明顯減少，說明當(dāng)歸注射液減弱了缺氧對神經(jīng)元的損傷，起到了保護(hù)作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究，可能與以下幾方面有關(guān)[9，10]：①擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)。當(dāng)歸揮發(fā)油緩解血管平滑肌的痙攣，擴(kuò)張血管，從而減少血管阻力，增加外周血流量，改善局部微循環(huán)，使胚胎缺氧得以改善;②對子宮的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)歸抑制子宮平滑肌收縮，降低對宮血管的壓迫，增加子宮血流量，從而增加胎盤的物質(zhì)交換量;③清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用。細(xì)胞缺血缺氧時(shí)發(fā)生能量代謝失常、鈣超載和氧自由基生成，阿魏酸是當(dāng)歸抗氧化作用的有效成分。綜上分析，當(dāng)歸注射液可能通過擴(kuò)張血管、抑制子宮平滑肌收縮，并通過清除氧自由基，減少神經(jīng)元的鈣超載，從而改善胚胎大鼠腦的缺氧狀態(tài)，改善神經(jīng)元的代謝，而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

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