細(xì)胞總RNA的提取操作步驟一、 準(zhǔn)備1、 物品:Trizol、氯仿（三氯甲烷）、異丙醇、75%滅酶異醇、冷PBS、1.5ml滅酶EP管、滅酶槍頭、一次性手套、EP管架、吸管2、 打開冷凍離心機(jī)4?預(yù)冷二、 操作步驟：將Trizol、氯仿、冷PBS、EP管、滅酶槍頭、一次性手套、EP管架、吸管等物品帶入細(xì)胞室。1、 取出EP管、做好標(biāo)記2、 取出細(xì)胞、收集上清保存?zhèn)溆?、 用冷PBS沖洗細(xì)胞兩次4、 加入1mlTrizol（24孔板每孔加0.5ml即可），調(diào)小刻度用移液器吹打細(xì)胞至液體澄清（生化:搖動(dòng)混勻后室溫孵育10min）5、 將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml滅酶EP管中，用黃槍頭加入氯仿0.2ml（1/5Trizol體積），用手劇烈震搖15秒，置室溫5min（生化:3mindxyer:15min），分層6、4?、12000g（12300rcf）離心15min，可見(jiàn)分層。7、 用黃槍頭小心收集上層水相約0.5ml置于另一1.5ml滅酶EP管中（確保不要吸入中間層和有機(jī)相）。8、 各管分別加入0.5ml異丙醇（等體積），用力搖勻，置室溫10min°（提前將異丙醇4?預(yù)冷，或混勻后置-20?60min，提取效果更好）9、 4?、12000g離心10min，可見(jiàn)RNA沉淀。10、 倒棄上清，用濾紙吸干管口余液，加入預(yù)冷的75%滅酶異醇1ml,用指輕彈管壁使RNA沉淀飄起洗滌。11、 4?、7500g(7700rcf)離心5min，生化為10min，(亦有dxyer用12000g)，沉淀即為總RNA。12、 棄上清，真空干燥約4min或空氣中干燥5~10min，加入20閆(30M)DEPC水。56?水浴小于10min助溶，取少量測(cè)OD值，其余-70?保存?zhèn)銻NA制備的問(wèn)題與解答1、 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理塑料制品：盡可能使用無(wú)菌，一次性塑料制品。已標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如沒(méi)有開封使用過(guò)，通常沒(méi)有必要再次處理。對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理方法如下：在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意:DEPC為劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。在通風(fēng)柜中室溫處理過(guò)夜。將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過(guò)的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。玻璃和金屬物品250?C烘烤3小時(shí)以上。2、 RNase是RNA制備的殺手RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。取RNase-free的物品時(shí)必須戴手套。3、 采用什么方式純化總RNA,答:我們提供多種RNA純化方式，根據(jù)您對(duì)RNA純化技術(shù)的熟悉程度，選用不同的純化手段。從產(chǎn)品使用效果看，基于TriBlue的一步法分離總RNA試劑盒（K311,K321系列）無(wú)論是新手還熟手都可以得到比較理想的結(jié)果。如果您對(duì)苯酚過(guò)敏，出于對(duì)環(huán)境的保護(hù)，您可以選用整個(gè)分離流程都不使用苯酚的試劑盒（K361系列）。從產(chǎn)品形式上，我們的總RNA分離分醇沉淀離心式和離心吸附柱方式兩種。沉淀方式總的產(chǎn)量比較高，純化規(guī)模機(jī)動(dòng)，但是純度不及吸附柱方式;吸附柱方式操作比較簡(jiǎn)單，純度高，受吸附容量的影響，產(chǎn)量收到影響。4、 什么時(shí)候需要分離mRNA?答:常規(guī)RT-PCR鑒定基因表達(dá)水平的，一般都可以采用總RNA作為RT-PCR的模板，但是做cDNA文庫(kù)，克隆豐度極低的基因，大多數(shù)DD-PCR，削減雜交等需要純化的mRNA。一般用oligo（dT）-cellulose或在磁珠上偶連oligo（dT），從組織或總RNA種直接分離mRNA。5、 如何判定分離的總RNA的純度，答:需要從兩個(gè)方面著手，缺一不可，特別是新手（1）測(cè)定OD260/OD280的比值，測(cè)定時(shí)，RNA需要用10mMTris-HCl,pH7.5稀釋。理想的RNA,OD260/280在1.9-2.1之間。比值如果過(guò)低，可能有蛋白質(zhì)污染，過(guò)高RNA可能已發(fā)生降解。⑵瓊脂糖變性電泳觀察rRNA的完整性和強(qiáng)度。變性電泳需要采用MOPS系統(tǒng)，不可以采用DNA電泳用的TBE或TAE系統(tǒng)。如果OD260/OD280過(guò)低(<1.7)，通?？梢酝ㄟ^(guò)減少組織和細(xì)胞的用量來(lái)實(shí)現(xiàn)。6、什么時(shí)候需要加入RNA-Carrier?答:樣品很少或樣品中RNA含量低，制備RNA時(shí)需要加入一定的RNA載體，以提高RNA純化的得率。常用的載體有PolyAcrylCarrier,PolyA,PolyC和Glycogen。一定濃度范圍的Carrier對(duì)一些RNA的下游應(yīng)用沒(méi)有影響，如RT-PCR,NorthernBlot。7、 如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA?答:無(wú)論用種方式制備的總RNA,要絕對(duì)保證不含基因組DNA是不現(xiàn)實(shí)的。如果您希望得到DNAfree的RNA樣品，需要用RNasefree的DNaseI處理。8、 純化的RNA樣品如何保存，答:如果希望得到最佳的結(jié)果，純化的RNA需要立即用于下游實(shí)驗(yàn)。RNA可以保存在-80C冰箱，長(zhǎng)期保存可以置于液氮中。如果沒(méi)有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在異丙醇或乙醇中，-20度保存。9、 組織和細(xì)胞樣品如何收集，保存，答:組織樣品收集后，需要立即保存在液氮中，或在樣品中加入一定量的保護(hù)劑，有一些商業(yè)化的產(chǎn)品可以選用。一般實(shí)驗(yàn)收集50-100mg組織就足夠了。10、 如何估計(jì)RNA的產(chǎn)量，答:能計(jì)算出RNA的產(chǎn)量，通常都是有比較多的起材料，但是很多情況下能夠取得材料很少，所制備得到的RNA無(wú)法通過(guò)分光光度的方法測(cè)定含量和濃度。RNA的含量與組織和細(xì)胞的類型有比較大的關(guān)系，同時(shí)與抽提的方式有關(guān)，例如用抽提小鼠組織100mg肝可以得到500ug總RNA,100mg肺得到200ug總RNA,1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞Hela細(xì)胞可以得到15ug左右的總RNA.mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%。根據(jù)這樣一些經(jīng)驗(yàn)值，估算出您可能得到的量。樣品如果低于20mg或10000個(gè)細(xì)胞，在抽提時(shí)需要考慮加入合適的RNA沉淀載體。11、RNA制備過(guò)程中那個(gè)環(huán)節(jié)要特別注意，答:一般情況下，細(xì)胞和組織在RNA抽提液中都可以保存一段時(shí)間，因?yàn)閹缀跛械腞NA的抽提裂解液中都含有高濃度的異硫氤酸胍等強(qiáng)變性劑，RNase基本是不起作用的，操作即使是粗放一些，也沒(méi)有多達(dá)關(guān)系。但是通常是離心后取上清，這時(shí)候RNA已沒(méi)有保護(hù)，操作要特別小心。RNA抽提指南（TRIZOL）注意事項(xiàng)：*全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來(lái)源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。*使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實(shí)驗(yàn)室可能用RNA酶A或T1來(lái)降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動(dòng)吸管）可能富含RNA酶。*在TRIZOL中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對(duì)樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無(wú)RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150?C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。抽提步驟：1（勻漿化作用通過(guò)離心來(lái)沉淀細(xì)胞后，棄上清，用移液管加TRIZOL試劑反復(fù)吹打來(lái)裂解細(xì)胞至均一通亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在15—30?C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。67（每5—10X10的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1X10細(xì)菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞因?yàn)槟菢訒?huì)增加mRNA降解的可能性。）2（分離階段每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在30?C下孵育2—3分鐘。在2—8?C下以不超過(guò)12,000Xg的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層:下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%3(RNA的沉淀將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA。最初均化時(shí)的每1mlTRIZOL對(duì)應(yīng)0.5ml異丙醇。將混合的樣品在15—30?C條件下孵育10分鐘并在2—8?C下以不超過(guò)12,000Xg的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。(如果希望分離DNA和蛋白，有機(jī)層同樣要予以保留。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對(duì)于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。)4(RNA的洗脫移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，每1ml的TRIZOL至少加1ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8?C下以不超過(guò)7,500Xg的離心力高速冷凍離心5分鐘。5(RNA的再溶解在操作的最后，簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A比值＜1.6。用移液管尖分幾次移260/280取無(wú)RNA酶的水或0.5%SDS溶液來(lái)溶解RNA，并在55—60?C下孵育10分鐘。TRlzol,法抽提總RMA蛆蛆10峰 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