Discovery1993年,LeeRC等在線蟲(C.elegans)中意外地發(fā)現了一種定時調控胚胎后期發(fā)育的miRNA-lin4,它是一種非編碼RNA,長度為22nt。2000年,miRNA-let7的發(fā)現掀起了尋找miRNA的熱潮。在線蟲（C.elegans）當中,通過功能缺失突變體的篩選，找到了let-7/lin-41基因當前第1頁\共有60頁\編于星期四\5點不同物種中的let-7基因具有序列保守性,且均可與lin-41基因的3’UTR區(qū)域互補在lin-41基因的3’UTR區(qū)域發(fā)現了let-7的互補區(qū)當前第2頁\共有60頁\編于星期四\5點TranscriptionofmiRNAgenesbyRNAPolIITranscribedbypolIItopri-miRNA(primaryprecursor)Pri-miRNAcontainsthe7-methylguanosinecapandapoly(A)tailPolIIisphysicallyassociatedwithmiRNAgenepromotersmiRNAgenetranscriptionissensitiveto-amanitinPolIIdependenttranscriptionenablestemporalandspatialregulationofmiRNAproduction.Biogenesis當前第3頁\共有60頁\編于星期四\5點當前第4頁\共有60頁\編于星期四\5點DuandZamore,Development132,4645-4652.animalsplantsBiogenesis當前第5頁\共有60頁\編于星期四\5點ComplexloadingselectionMalloryetal.,CurrentOpinioninPlantBiology(2008)5’terminaldependentmiRNAsorting當前第6頁\共有60頁\編于星期四\5點microRNA的作用機理ReductionofmRNAstabilityPlantmiRNAsguidecleavageoftargetmRNAs(howeveronlyafewmiRNAtargetshavebeenexaminedattheproteinlevel)AnimalmiRNAsalsoreducestabilityoftargetmRNAsInhibitionofmRNAtranslationlin-4mediatedregulationoflin-14;let-7mediatedregulationoflin-41OtheranimalmiRNAscausereducedtargetproteinlevelswithoutaffectingtargetmRNAlevelsincellcultureAtleastthreeexamplesofplantmiRNAsaffectingtargetproteinbutnotmRNAlevels當前第7頁\共有60頁\編于星期四\5點當前第8頁\共有60頁\編于星期四\5點miRNA介導的翻譯抑制機制當前第9頁\共有60頁\編于星期四\5點與小分子siRNA相比，miRNA在分子特性等方面是相似的，但也存在不少的差異。siRNA是雙鏈RNA，3‘端有2個非配對堿基，通常為UU；miRNA是單鏈RNA。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下產生，而成熟miRNAs的產生要復雜一些。與siRNA所介導的基因沉默機制不同的是，miRNA是一種內源基因的調控機制，代表了生物自身的一套正常程序。miRNA對靶基因的調控并不依賴于其與靶基因序列的高度互補性，如果miRNA與靶基因mRNA存在完全或者近乎完全互補配對，則通過靶基因mRNA的斷裂方式調控基因表達；反之，miRNA則是通過翻譯抑制調控靶基因的表達，miRNAs的這種調控方式主要依賴于miRNA的5’端2-8寡核苷酸序列“seedregion”與靶基因mRNA的3’UTR互補得以實現。當前第10頁\共有60頁\編于星期四\5點8.5.1蛋白質磷酸化對基因轉錄的調控

細胞是生命活動的基本單位。細胞通過DNA的復制和細胞分裂將本身所固有的遺傳信息由親代傳至子代，實現增殖繁衍。它們還不斷地“感知”環(huán)境變化，并對其作出特定的應答。細胞應答可以分為3個階段：外界信息的“感知”，即由細胞膜到細胞核內的信息傳遞,染色質水平上的基因活性調控,特定基因的表達，即從DNA→RNA→蛋白質的遺傳信息傳遞過程。8.5真核基因其他水平上的表達調控當前第11頁\共有60頁\編于星期四\5點

蛋白質的磷酸化與去磷酸化過程是生物體內普遍存在的信息傳導調節(jié)方式，幾乎涉及所有的生理及病理過程，如糖代謝、光合作用、細胞的生長發(fā)育、神經遞質的合成與釋放甚至癌變等等。當前第12頁\共有60頁\編于星期四\5點真核細胞主要跨膜信號傳導途徑當前第13頁\共有60頁\編于星期四\5點細胞表面的三類受體示意圖當前第14頁\共有60頁\編于星期四\5點受體分子活化細胞功能的途徑主要有兩條：受體本身或受體結合蛋白具有內源酪氨酸激酶活性，胞內信號通過酪氨酸激酶途徑得到傳遞；配體與細胞表面受體結合，通過G蛋白介異的效應系統(tǒng)產生介質，活化絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸激酶，從而傳遞信號。到目前為止，已發(fā)現的蛋白激酶基因多達2000余個。根據底物蛋白質被磷酸化的氨基酸殘基種類可分為三大類：1、絲氨酸/蘇氨酸型，2、酪氨酸型，3、組氨酸型。根據是否有調節(jié)物參與蛋白激酶的活性可分為兩大類：信使依賴型和非信使依賴型。當前第15頁\共有60頁\編于星期四\5點

細胞表面受體與配體分子的高親和力特異性結合，能誘導受體蛋白構象變化，使胞外信號順利通過質膜進入細胞內，或使受體發(fā)生寡聚化而被激活。當前第16頁\共有60頁\編于星期四\5點蛋白質磷酸化和GTP結合蛋白參與的信號轉導過程當前第17頁\共有60頁\編于星期四\5點G蛋白（GTPbindingproteins）所有能與GTP結合的蛋白質都可以稱為“G蛋白”，并不是都參與細胞信號傳遞。所有的GTP結合蛋白都具有水解GTP生成GDP的能力，即具有GTP酶的特性，所以把所有GTP結合蛋白都歸屬于“G蛋白超家族”（GTP-bindingproteinsuperfamily）。在研究信號傳遞時特指與細胞表面受體偶聯(lián)的異三聚體G蛋白（heterotrimericGTPbindingprotein）。G蛋白的基本結構：100kD左右，由α、β、γ三種亞基組成，在天然電泳中β與γ仍緊密結合在一起。α亞基分子量在39-46kD之間，差別最大，被用作G蛋白的分類依據。其共同的特點是，具有一個GTP結合位點，本身具有GTP酶的活性，即可以把GTP水解成GDP和無機磷酸.當前第18頁\共有60頁\編于星期四\5點異質G蛋白介導的生理效應配體受體效應物生理效應腎上腺素β-腎上腺受體腺苷酸環(huán)化酶糖原水解血清緊張素血清緊張素受體腺苷酸環(huán)化酶行為敏感好學光視紫紅質cGMP磷酸二酯酶視覺興奮IgE抗原復合物肥大細胞Ig-受體磷脂酶C分泌f-Met肽趨化受體磷脂酶C趨化性乙酰膽堿毒蠅堿受體K+通道降低起搏活性配體受體效應物當前第19頁\共有60頁\編于星期四\5點不同的Gα激發(fā)不同的調節(jié)途徑當前第20頁\共有60頁\編于星期四\5點1.受cAMP水平調控的A激酶依賴于cAMP的蛋白激酶稱為A激酶（PKA），它能把ATP分子上的末端磷酸基團加到某個特定蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基上。被A激酶磷酸化的氨基酸N端上游往往存在兩個或兩個以上堿性氨基酸，特定氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-X-Ser-X）改變了這一蛋白的酶活性。在不同的細胞中，A激酶的反應底物不一樣，所以，cAMP能在不同靶細胞中誘發(fā)不同的反應。當前第21頁\共有60頁\編于星期四\5點A激酶當前第22頁\共有60頁\編于星期四\5點非活性狀態(tài)的PKA全酶由4個亞基R2C2所組成，分子量約為150-170，調節(jié)亞基與cAMP相結合，引起構象變化并釋放催化亞基，后者隨即成為有催化活性的單體。當前第23頁\共有60頁\編于星期四\5點糖原代謝時，激素與其受體在肌肉細胞外表面相結合，誘發(fā)細胞質cAMP的合成并活化A激酶，后者再將活化磷酸基團傳遞給無活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最終將糖原磷酸化，進入糖酵解過程并提供ATP。當前第24頁\共有60頁\編于星期四\5點2.C激酶與PIP2、IP3和DAG該蛋白激酶活性是依賴于Ca2+的，故稱C激酶（PKC）。IP3(肌醇-1,4,5-三磷酸)引起細胞質Ca2+濃度升高，導致C激酶從胞質轉運到靠近原生質膜內側處，并被DAG(二酰基甘油)和Ca2+的雙重影響所激活。DAG提高了C激酶對于Ca2+的親和力。C激酶是一個7.7×104的蛋白質，主要實施對絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化，具有一個催化結構域和一個調節(jié)結構域。與DAG結合以后還能解除調節(jié)區(qū)所造成的抑制作用，提高酶活性。當前第25頁\共有60頁\編于星期四\5點C激酶磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸二酰基甘油肌醇-1,4,5-三磷酸當前第26頁\共有60頁\編于星期四\5點激酶信號傳遞及基因表達示意圖磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸二?；视虳AG肌醇-1,4,5-三磷酸當前第27頁\共有60頁\編于星期四\5點3.CaM激酶及MAP激酶Ca2+的細胞學功能主要通過鈣調蛋白激酶（CaM-kinase）來實現的，它們也是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，但僅應答于細胞內Ca2+水平。MAP激酶（mitogenactivatedproteinkinase，絲裂原活化蛋白激酶）活性受許多外源細胞生長、分化因子的誘導。MAP-激酶活性取決于該蛋白中僅有一個氨基酸之隔的酪氨酸、絲氨酸殘基是否都被磷酸化。當前第28頁\共有60頁\編于星期四\5點能同時催化這兩個氨基酸殘基磷酸化的酶被稱為MAP-激酶-激酶，它的反應底物是MAP激酶。MAP-激酶-激酶本身能被MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同時被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，從而在信息傳導中發(fā)揮功能。當前第29頁\共有60頁\編于星期四\5點4.蛋白質磷酸化與細胞分裂調控細胞通過p53及p21蛋白控制CDK（cyclin-dependentproteinkinase,周期蛋白依賴的蛋白激酶）活性，調控細胞分裂的進程。P21蛋白過量時，大量周期蛋白（cyclin）E-CDK2復合物與P21蛋白相結合，使CDK2喪失磷酸化PRb蛋白（retinoblastomaprotein，視網膜母細胞瘤蛋白）的功能。沒有被磷酸化的PRb蛋白與轉錄因子E2F相結合并使后者不能激活與DNA合成有關的酶，導致細胞不能由G1期進入S期，細胞分裂受阻。當前第30頁\共有60頁\編于星期四\5點如果細胞中P53基因活性降低，P21蛋白含量急劇下降，周期蛋白E-CDK2復合物就能有效地將PRb蛋白磷酸化。此時，PRb蛋白不能與E2F相結合，后者發(fā)揮轉錄調控因子的作用，激活許

多與DNA合成有關的基因表達，細胞從G1期進入S期，開始分裂。當前第31頁\共有60頁\編于星期四\5點CDK（周期蛋白依賴的蛋白激酶）活性受雙重調控沒有周期蛋白，CDK無活性。隨著周期蛋白的合成和積累，逐步形成周期蛋白-CDK復合物。CDK上的酪氨酸位點被磷酸化，掩蓋了其ATP結合位點，ATP不能有效地與之相結合，CDK仍然無活性。CDK蛋白T-環(huán)中的蘇氨酸位點被磷酸化，并將其酪氨酸位點上的磷酸基團去掉，其才能發(fā)揮生物學活性。同時，CDK蛋白還能使細胞中的磷酸酯酶磷酸化，以加速脫去自身酪氨酸位點上的磷酸基團。有生物活性的周期蛋白-CDK復合物能將DBRP(destructionboxrecognizingprotein)磷酸化，激活泛素連接酶，把大量泛素加到周期蛋白上并使之迅速降解，CDK失活，新的周期開始。當前第32頁\共有60頁\編于星期四\5點8.5.3激素對基因表達的影響激素（Hormone）是高度分化的內分泌細胞合成并直接分泌入血的化學信息物質，它通過調節(jié)各種組織細胞的代謝活動來影響人體的生理活動。它是由內分泌腺或內分泌細胞分泌的高效生物活性物質，在體內作為信使傳遞信息，對機體生理過程起調節(jié)作用。現在把凡是通過血液循環(huán)或組織液起傳遞信息作用的化學物質，都稱為激素。激素的分泌均極微量，為毫微克（十億分之一克）水平，但其調節(jié)作用均極明顯。激素作用甚廣，但不參加具體的代謝過程，只對特定的代謝和生理過程起調節(jié)作用，調節(jié)代謝及生理過程的進行速度和方向，從而使機體的活動更適應于內外環(huán)境的變化。激素的作用機制是通過與細胞膜上或細胞質中的專一性受體蛋白結合而將信息傳入細胞，引起細胞內發(fā)生一系列相應的連鎖變化，最后表達出激素的生理效應。當前第33頁\共有60頁\編于星期四\5點幾種常見的疏水性小分子激素的結構式當前第34頁\共有60頁\編于星期四\5點1激素對靶基因的影響許多類固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮質激素和雄激素）以及一般代謝性激素（如胰島素）的調控作用都是通過起始基因轉錄而實現的。體內存在的許多糖皮質類激素應答基因都有一段大約20bp的順式作用元件（激素應答元件，簡稱HRE），該序列具有類似增強子的作用，其活性受激素制約。靶細胞中含有大量激素受體蛋白，而非靶細胞中沒有或很少有這類受體。激素元件序列糖皮質GRETGGTACANNNTGTTCG雌激素EREGGTCANNNTGTCC甲狀腺素TRECAGGGACGTGACCGCA當前第35頁\共有60頁\編于星期四\5點固醇類激素的受體蛋白分子有相同的結構框架，包括保守性極高并位于分子中央的DNA結合區(qū)，位于C端的激素結合區(qū)和保守性較低的N端。研究表明，激素、受體與順式元件的結合位點三者缺一不可，其中無論是受體蛋白與激素的結合，還是激素本身，都不是與DNA結合并激活轉錄所必需的。通常情況下，受體蛋白中激素結合結構域妨礙了DNA結合區(qū)及轉錄調控區(qū)發(fā)揮生理功能，只有與相應激素結合后才能打破這種障礙。當前第36頁\共有60頁\編于星期四\5點當前第37頁\共有60頁\編于星期四\5點Glucocorticoidsregulategenetranscriptionbycausingtheirreceptortotransportintothenucleusandbindtoanenhancerwhoseactionisneededforpromoterfunction.當前第38頁\共有60頁\編于星期四\5點當前第39頁\共有60頁\編于星期四\5點2.激素的作用機制有3種較為流行的假說：受體流動假說。激素-受體復合物可在膜內移動并與腺苷酸環(huán)化酶結合，激活環(huán)化酶，引發(fā)后續(xù)效應。通過激素的稀釋或解離，使受體和環(huán)化酶回復到非耦聯(lián)狀態(tài)。中介物假說。受體與酶之間可能通過膜脂耦聯(lián)在一起。有人用適量的高純磷脂酶A處理肝細胞膜后發(fā)現，此時氟離子仍可刺激膜上的腺苷酸環(huán)化酶活性，但對胰高血糖素的作用完全喪失。若加入膜脂則激素的作用恢復，說明去膜脂后激素的信息傳遞中斷。鄰位互調假說。根據GTP能影響激素與受體結合并進而影響腺苷酸環(huán)化酶活性的現象，認為該酶系統(tǒng)至少存在3個活性部位，即激素-受體結合部位、Mg2+-ATP作用中心和核苷酸調節(jié)部位。因為腺苷酸環(huán)化酶有幾種不同的立體構象，激素與GTP協(xié)同作用可使這幾種不同的構象之間發(fā)生互變。當前第40頁\共有60頁\編于星期四\5點8.5.4熱激蛋白誘導的基因表達能與某個（類）專一蛋白因子結合，從而控制基因特異表達的DNA上游序列稱為應答元件。應答元件主要有：熱激應答元件（HSE）糖皮質應答元件（GRE）金屬應答元件（MRE）應答元件與細胞內專一的轉錄因子相互作用，協(xié)調相關基因的轉錄。調控因子應答元件DNA序列結合蛋白熱激HSECNNGAANNTCCNNGHSF鎘MRECGNCCCGGNCNC？佛波酯TRETGACTCAAP1血清SRECCATATTAGGSRF當前第41頁\共有60頁\編于星期四\5點許多生物在最適溫度范圍以上，能受熱誘導合成一系列熱休克蛋白（heatshockprotein）。受熱后，果蠅細胞內Hsp70mRNA水平提高1000倍，就是因為熱激因子（heatshockfactor，HSF）與hsp70基因TATA區(qū)上游60bp處的HSE相結合，誘發(fā)轉錄起始。當前第42頁\共有60頁\編于星期四\5點熱激蛋白調控的基因表達機制當前第43頁\共有60頁\編于星期四\5點當前第44頁\共有60頁\編于星期四\5點當前第45頁\共有60頁\編于星期四\5點8.5.5RNA的加工成熟各種基因的轉錄產物都是RNA，無論是rRNA、tRNA還是mRNA，初級轉錄的產物只有經過加工，才能成為有生物功能的活性分子。1.rRNA和tRNA的加工成熟rRNA加工有兩個內容，一個是分子內的切割，另一個是化學修飾。真核生物的rRNA基因轉錄時先產生一個45S的前體rRNA，然后前體rRNA很快就會被加工降解，生成不同相對分子質量的成熟rRNA。rRNA的化學修飾主要是核糖甲基化。tRNA基因轉錄時也可能先生成前體tRNA，tRNA基因的初級轉錄產物在進入細胞質后，首先經過核苷的修飾，生成4.5S前體tRNA，再剪接成為成熟tRNA(4S)。當前第46頁\共有60頁\編于星期四\5點原核rRNA前體加工示意當前第47頁\共有60頁\編于星期四\5點2mRNA的加工成熟編碼蛋白質的基因轉錄產生mRNA。這類基因產物在轉錄后要進行一系列的加工變化，才能成為成熟的有生物功能的mRNA。這些加工主要包括在mRNA的5'末端加"帽子"，在其3'末端加上poly(A)，進行RNA的剪接以及核苷酸的甲基化修飾等。由于mRNA的這些結構與它作為蛋白質合成模板的功能有密切關系，所以是基因表達的重要調控環(huán)節(jié)。編碼蛋白質的基因轉錄時首先生成前體pre-mRNA(或稱核不均一RNA，hnRNA)，然后再加工剪接為成熟mRNA。當前第48頁\共有60頁\編于星期四\5點3真核生物基因轉錄后加工的多樣性真核生物的基因可以按其轉錄方式分為兩大類：簡單轉錄單位復雜轉錄單位。這兩種轉錄方式雖然最終都產生蛋白質，但它們的轉錄后加工方式是不同的。當前第49頁\共有60頁\編于星期四\5點簡單轉錄單位。這類基因只編碼產生一個多肽，其原始轉錄產物有時需要加工，有時則不需要加工。有3種不同形式：第一種簡單轉錄單位，如組蛋白基因，它們沒有內含子，因此不存在轉錄后加工問題，其mRNA3’末端沒有poly(A)，但有一個保守的回文序列作為轉錄終止信號。第二種簡單轉錄單位包括腺病毒蛋白IX、α-干擾素和許多酵母蛋白質基因，它們沒有內含子，所編碼的mRNA不需要剪接，但需要加poly(A)。第三種簡單轉錄單位包括α和β-珠蛋白基因及許多細胞蛋白基因，這些基因雖然都有內含子，需要進行轉錄后加工剪接，還要加poly(A)，但它們只產生一個有功能的mRNA，所以仍然是簡單轉錄單位。當前第50頁\共有60頁\編于星期四\5點簡單轉錄單位轉錄后加工有3種不同形式當前第51頁\共有60頁\編于星期四\5點復雜轉錄單位。含有復雜轉錄單位的主要是一些編碼組織和發(fā)育特異性蛋白質的基因，它們除了含有數量不等的內含子以外，其原始轉錄產物能通過多種不同方式加工成兩個或兩個以上的mRNA。也有三種情況：利用多個5’端轉錄起始位點或剪接位點產生不同的蛋白質利用多個加poly(A)位點和不同的剪接方式產生不同的蛋白質。這類基因調控點不在5‘末端和內含子的不同剪接，而在于有兩個或多個加poly(A)位點，因此可通過不同的剪接方式得到不同的蛋白質。雖無剪接，但有多個轉錄起始位點或加polyA位點的基因。當前第52頁\共有60頁\編于星期四\5點當前第53頁\共有60頁\編于星期四\5點

前mRNA不同的剪接方式造成了不同組織中不同的降鈣素樣蛋白當前第54頁\共有60頁\編于星期四\5點mRNA有效性的調控真核生物能否長時間、及時地利用成熟的mRNA分子翻譯出蛋白質以供生長、發(fā)育的需要，是與mRNA的穩(wěn)定性以及屏蔽狀態(tài)的解除密切相關的。原核生物mRN