第四章_動物細胞工程制藥演示文稿當前第1頁\共有73頁\編于星期三\11點優(yōu)選第四章_動物細胞工程制藥當前第2頁\共有73頁\編于星期三\11點轉(zhuǎn)基因動物20世紀70年代中期，基因重組技術(shù)與細胞工程技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物。1974年,HJaenisch和MinZe首次報道向小鼠囊胚注射SV40DNA后，生產(chǎn)的小鼠部分組織中檢測到了SV40rDNA序列。1980年,Gordon等人通過向小鼠的單細胞胚胎原核注射純化的DNA---人胸苷激酶基因，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。這是一只得真正意義的第一只轉(zhuǎn)基因動物。當前第3頁\共有73頁\編于星期三\11點轉(zhuǎn)基因碩鼠1982年P(guān)almiter等人將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?獲得比普通小鼠生長速度快2~4倍，震驚了世界。轉(zhuǎn)基因“碩鼠”（右）當前第4頁\共有73頁\編于星期三\11點生物反應器研發(fā)在此后幾年中，以改進經(jīng)濟性狀為目的的轉(zhuǎn)基因動物研究成為熱點課題。但除轉(zhuǎn)基因魚外，多數(shù)轉(zhuǎn)基因動物并沒有達到預想的要求。當前第5頁\共有73頁\編于星期三\11點Gordon于1987年獲得了分泌組織纖溶酶原激活因子tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠。以后的數(shù)年內(nèi)，轉(zhuǎn)基因羊、豬、牛的乳腺生物反應器便相繼問世，利用此生產(chǎn)出了多種生物藥物：凝血因子Ⅸ、凝血因子XIII、抗胰蛋白酶、tPA、紅細胞生成素（EPO）等。動物克隆技術(shù)、干細胞技術(shù)等與轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)相結(jié)合，加快了動物生物反應器的研究與應用進程。當前第6頁\共有73頁\編于星期三\11點乳汁中分泌人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊美國轉(zhuǎn)基因豬，其體內(nèi)含有人類的基因，乳汁含有人體蛋白fatorⅧ。只需300～600只這樣的母豬就能滿足全世界對這種蛋白的需求。當前第7頁\共有73頁\編于星期三\11點美國麻省生物技術(shù)公司（GTC，Biotherapeutics）利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)開發(fā)、生產(chǎn)和商業(yè)化治療用蛋白質(zhì)。ATryn是GTC生物治療公司開發(fā)的一種人抗凝血酶重組蛋白，它是第一個在世界上得到認可的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的蛋白。2006年6月宣布，美國GTC公司用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的人抗凝血酶“ATryn”（α-antithrombin）獲得歐洲藥品評價局（EMEA）人用藥品委員會（CHMP）的批準推薦。

2009年2月，F(xiàn)DA首次批準由轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物-人抗凝血酶“ATryn”上市。

當前第8頁\共有73頁\編于星期三\11點二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的原理和方法（一）基本原理體外構(gòu)建的重組DNA分子通過顯微注射，病毒載體轉(zhuǎn)移，胚胎干細胞轉(zhuǎn)染等方法注入動物的受精卵或床前的胚胎細胞，然后將此受精卵或胚胎細胞植入子宮，使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動物當前第9頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第10頁\共有73頁\編于星期三\11點外源目的基因的制備外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞選擇獲得攜有目的基因的細胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系當前第11頁\共有73頁\編于星期三\11點（二）外源目的基因轉(zhuǎn)入動物的早期胚胎方法1.顯微注射法在光學顯微鏡下，利用顯微操作儀，直接把DNA注射到動物早期胚胎、胚胎干細胞、體細胞或卵母細胞中，然后生產(chǎn)動物個體的技術(shù)。當前第12頁\共有73頁\編于星期三\11點microinjection經(jīng)過顯微注射DNA發(fā)育而成的動物中，有少數(shù)整合了被注射的DNA分子，成為轉(zhuǎn)基因動物。目前是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動物的最有效，最成功的途徑當前第13頁\共有73頁\編于星期三\11點基質(zhì)附著序列當前第14頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第15頁\共有73頁\編于星期三\11點通過注射妊娠血清和人絨毛膜促進腺激素的激素療法使小鼠超數(shù)排卵35個（一般情況下排卵5-10個）交配后，從輸卵管內(nèi)取出受精卵；轉(zhuǎn)基因樣品注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi)將25-40個注射了轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi)；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品，進行雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位子代小鼠間進行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達。

DNA顯微注射法的基本程序當前第16頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第17頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第18頁\共有73頁\編于星期三\11點優(yōu)點：轉(zhuǎn)基因范圍廣轉(zhuǎn)移基因大，可達數(shù)百kb；且轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對安全。非嵌合體已成功制備轉(zhuǎn)基因的鼠，兔，羊，豬缺點：整合機制不明確，無規(guī)律隨機整合，多拷貝整合導致轉(zhuǎn)基因不表達整合位點隨機會造成轉(zhuǎn)動物基因組的重排、突變、易位缺失等需顯微操作儀，技術(shù)性要求強。

成功率低當前第19頁\共有73頁\編于星期三\11點2.反轉(zhuǎn)錄病毒感染法將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共同培養(yǎng)以達到感染目的）獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法．在培育轉(zhuǎn)基因禽類研究中有廣泛應用，是目前制備轉(zhuǎn)基因雞最有效和最成功的方法，主要集中在雞的良種培育及抗病毒感染研究方面。

當前第20頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第21頁\共有73頁\編于星期三\11點如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因組中，可獲得轉(zhuǎn)基因動物在第一次卵裂之后整合，會產(chǎn)生嵌合體，其第二代可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物。

當前第22頁\共有73頁\編于星期三\11點（1）反轉(zhuǎn)錄病毒基因反式作用序列順式作用序列當前第23頁\共有73頁\編于星期三\11點（2）反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的載體的構(gòu)建復制型缺陷重組病毒載體的構(gòu)建：只能產(chǎn)生病毒RNA

不編碼結(jié)構(gòu)蛋白提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA；將環(huán)狀DNA克隆到適當?shù)妮d體中；選擇適當?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除；將外源目的基因克隆到載體中當前第24頁\共有73頁\編于星期三\11點（3）包裝細胞

在受體細胞中的重組病毒由于沒有包裝信號，能生產(chǎn)病病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒包裝細胞：染色體整合除序列的整個病毒基因組，為重組蛋白載體轉(zhuǎn)錄的RNA提供包裝蛋白病毒載體轉(zhuǎn)化受體細胞后，載體上的包裝信號將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。當前第25頁\共有73頁\編于星期三\11點（4）通過物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細胞利用反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動子的特點，外源基因隨病毒RNA轉(zhuǎn)錄，并在載體上序列的作用下，重組病毒轉(zhuǎn)錄的RNA和包裝細胞提供的包裝蛋白就可以組裝成有感染性的病毒顆粒病毒收獲后感染早期胚胎或直接感染受精卵。或構(gòu)建好的DNA注射入囊胚腔中和重組病毒及輔助病毒共培養(yǎng)進行轉(zhuǎn)染當前第26頁\共有73頁\編于星期三\11點優(yōu)點：同時感染大量胚胎整合率高，轉(zhuǎn)基因整合后能穩(wěn)定地遺傳單拷貝整合型不需復雜設(shè)備缺點：外源基因難植入生殖系統(tǒng)，成功率低載量較小，一般只有8kb，不能插入大片段，缺少鄰近的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn)基因表達；當前第27頁\共有73頁\編于星期三\11點3.胚胎干細胞方法胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES）是從早期胚胎內(nèi)細胞團（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細胞。含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細胞?？梢栽隗w外進行人工培養(yǎng)，擴增，并能以克隆的形式保存。當前第28頁\共有73頁\編于星期三\11點胚胎干細胞介導法在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚。豬的胚胎干細胞克隆系，牛的胚胎干細胞。當前第29頁\共有73頁\編于星期三\11點ES細胞成為個體1.將ES細胞注入到動物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體轉(zhuǎn)基因動物。當前第30頁\共有73頁\編于星期三\11點2.通過核移植將ES導入去核的卵母細胞，在子宮種植發(fā)育成個體當前第31頁\共有73頁\編于星期三\11點胚胎干細胞轉(zhuǎn)基因過程當前第32頁\共有73頁\編于星期三\11點1.ES細胞的建立與維持動物的準備：受精后3.5天的母鼠分離鼠胚。胚胎的分離和初培養(yǎng)：3.5天孕鼠鼠斷頸處死解剖小鼠取出胚胎體外培養(yǎng)胚胎4-6天后，離散ICM。ICM的離散與ES的分離：分離ICM

酶解細胞團培養(yǎng)離散細胞ES細胞集落ES細胞的擴增：離散ES細胞置四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)ES細胞的常規(guī)培養(yǎng)：ES細胞由四孔板轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿進行常規(guī)培養(yǎng)當前第33頁\共有73頁\編于星期三\11點2.ES細胞的基因組操作

將外源基因移入到ES細胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達，又不影響ES細胞的各種功能。這就要求目的基因必須要定點參入，并且參入整合后，對原有基因結(jié)構(gòu)及功能沒有影響或影響最小。當前第34頁\共有73頁\編于星期三\11點與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列（HB1和HB2）轉(zhuǎn)入的目的基因（TG）編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor）兩個不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）定點參入當前第35頁\共有73頁\編于星期三\11點3.轉(zhuǎn)基因ES細胞的篩選——正負選擇法

正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細胞：重組DNA導入ES細胞，在含有G418的培養(yǎng)基中，沒有整合外源基因的細胞將全部死亡，只有整合了外源基因的細胞才可以存活下來。負選擇法篩選出特異整合型ES細胞：如果非特異性整合發(fā)生，則兩個tk基因或其中一個基因很大可能與TG和neor一起整合，這時用GCV篩選，tk基因表達的胸苷激酶能反GCV轉(zhuǎn)化成有毒的化合物，使細胞死亡。當前第36頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第37頁\共有73頁\編于星期三\11點4.轉(zhuǎn)基因ES細胞的檢測當前第38頁\共有73頁\編于星期三\11點5.移植將胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內(nèi)，繁育轉(zhuǎn)基因小鼠。當前第39頁\共有73頁\編于星期三\11點（6）獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠當前第40頁\共有73頁\編于星期三\11點優(yōu)點：整合率高同源重組實現(xiàn)定點整合，而非隨機整合缺點：不容易建立胚胎干細胞系長期培養(yǎng)，導入外源基因的胚胎干細胞會由于細胞分化使生產(chǎn)的動物成為嵌合體第一代是嵌合體，獲得轉(zhuǎn)基因動物的周期較長當前第41頁\共有73頁\編于星期三\11點4.精子載體導入法

將外源DNA與破壞細胞膜的精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導入受精卵。當前第42頁\共有73頁\編于星期三\11點意大利Lavitrano等1989年首次報道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。改進的方法是精子頭部纖維注射此法不僅可免去復雜而昂貴的設(shè)備，且可省去不少繁雜的操作和條件準備。但該法有些結(jié)果不穩(wěn)定，不能重復,外源DNA分子可能會受到受精液中內(nèi)切酶的作用而影響整合后的功能需在繼續(xù)改進當前第43頁\共有73頁\編于星期三\11點5.基因打靶(genetargeting)包括基因敲除(Knock-out)：靶基因被滅活.

無功能的外源基因轉(zhuǎn)入細胞與基因組中同源序列進行同源重組，把具有功能的同源序列置換出來，造成功能基因的缺失或失活.基因敲入(Knock-in):引入不存在的新基因.將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存在或已失活的細胞中與其基因組中同源序列進行同源重組，在細胞內(nèi)獲得表達，基因替代：基因修正(generepairment)當前第44頁\共有73頁\編于星期三\11點基因打靶的必備條件胚胎干細胞(ES細胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標志HSV-tk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)當前第45頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第46頁\共有73頁\編于星期三\11點基因敲除的技術(shù)路線如下：（1）構(gòu)建重組基因載體﹔（2）打靶載體導入ES細胞：重組置換（3）基因敲除ES細胞注射入胚泡（4）胚泡植入假孕小鼠的子宮中（5）嵌合體的雜交育種當前第47頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第48頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第49頁\共有73頁\編于星期三\11點O型載體，序列插入型載體，這類載體與靶基因組同源重組配對，經(jīng)過一次交換，前者插入后者，它發(fā)生單交換而將載體序列插入靶基因內(nèi)，致使染色體DNA部分重復，可能破壞內(nèi)在正?；蚨l(fā)生突變，也可代替原來缺陷基因，糾正遺傳特征，使靶基因特異失活。Ω型載體，也稱序列取代載體，外來載體DNA和靶細胞染色體DNA同源配對，經(jīng)過兩次交換，前者取代后者，此類載體可與靶序列發(fā)生雙交換，以外源序列取代靶序列，其基因組大小并無改變。基因打靶載體當前第50頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第51頁\共有73頁\編于星期三\11點6.YAC(YeastArtificialChromosome)

人工酵母染色體法transferlargegene/clustergene(100kb):YAC具有自主復制序列、克隆位點和可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因；還具有酵母菌染色體一些特點；可接受100－1000kb的外源DNA片段avoidDNAdamage:YAC已成為人類基因組計劃和圖位克隆基因的重要工具；當前第52頁\共有73頁\編于星期三\11點方法顯微注射核移植胚胎干細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒基因敲除精子介導優(yōu)點外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長度可達100Kb轉(zhuǎn)基因效率高；預測基因表達水平；可以使用定點整合技術(shù)外源DNA的整合率高；

整合在生殖細胞中的比例也很高。

可在整合點整合轉(zhuǎn)移基因的單個拷貝；該方法簡單、方便缺點精密儀器，技術(shù)操作較難，易造成宿主動物基因組的插入突變供體細胞易衰老ES細胞株不易建立，長期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物都是嵌合體

插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在動物各種組織中的分布不均

應用具有一定局限性有些結(jié)果不能重復

當前第53頁\共有73頁\編于星期三\11點三、轉(zhuǎn)基因動物反應器動物生物反應器（bioreactor）:目的片段在器官或組織中表達的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)１克藥物蛋白質(zhì)，用細胞基因工程需800-5000美元，而利用轉(zhuǎn)基因動物只需美元。一種新藥從研制到上市通常需要10-15年，而轉(zhuǎn)基因動物—乳腺生物反應器，生產(chǎn)周期僅為５年左右。當前第54頁\共有73頁\編于星期三\11點幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了乳腺生物反應器,血液生物反應器和膀胱生物反應器等。其中，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器的研究最為引人注目。當前第55頁\共有73頁\編于星期三\11點（一）動物乳腺反應器乳腺生物反應器的研制，就是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將外源基因?qū)雱游矬w內(nèi)，通過乳腺特異啟動子的控制，獲得乳腺生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物。藥用蛋白基因表達細胞株細胞核供體動物受精卵無核受精卵組裝的核細胞胚胎藥用蛋白乳汁雌性轉(zhuǎn)基因動物動物幼崽假孕動物受體動物當前第56頁\共有73頁\編于星期三\11點商業(yè)要求：1g/L乳腺是外分泌器官，乳汁不進入體內(nèi)循環(huán)，不會影響到轉(zhuǎn)基因動物本身的生理反應，從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中獲取的目的基因產(chǎn)物，不但產(chǎn)量高、易提純，而且表達的蛋白經(jīng)過了充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性，因此又被稱為動物乳腺生物反應器2006年8月，歐洲藥品估計局（EMEA）批準了哺乳動物細胞乳腺生物反應器（改名為乳腺生物反應器）

當前第57頁\共有73頁\編于星期三\11點1、動物乳腺是一個封閉的系統(tǒng)：表達的蛋白絕大部分不會回到血液循環(huán),避免大量表達的外源蛋白對動物健康的危害。2、乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。奶牛一年生產(chǎn)乳蛋白250-300kg,山羊生產(chǎn)乳蛋白25-30kg,家兔生產(chǎn)乳蛋白也可達到3-5kg。3、乳腺組織可以對人體蛋白質(zhì)進行正確的修飾和后加工，生物學活性接近天然產(chǎn)品。4、動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，獲得生產(chǎn)有價值蛋白質(zhì)的動物個體后,可以常規(guī)繁殖生產(chǎn)群體。當前第58頁\共有73頁\編于星期三\11點80年代，在鼠的乳腺組織高效表達了人AAT，開創(chuàng)了此研究的先河全世界有20-30家公司致力于開發(fā)動物乳腺生物反應器重組蛋白藥物，可進行商業(yè)生產(chǎn)的有近30種,包括人AAT、EPO、乳鐵蛋白、BSA、血紅蛋白，Ⅸ、Ⅷ和抗凝血酶Ⅲ、血纖維蛋白原、tPA等十余種稀有藥品，臨床試驗的有l(wèi)0余種，研發(fā)階段的有上百種．2006年6月，由美國Genzyme公司研制成功的第一個轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器生產(chǎn)的重組人抗凝血酶III（商品名：ATryn）已經(jīng)獲準上市當前第59頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第60頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第61頁\共有73頁\編于星期三\11點AAT轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有a-抗胰蛋白酶(AAT)

，可治療遺傳性肺氣腫病。每升羊奶售6000美元。英國PPL公司與德國拜耳公司生產(chǎn)

當前第62頁\共有73頁\編于星期三\11點當前第63頁\共有73頁\編于星期三\11點我國乳腺反應器的研制1996年研制成功的能在乳腺中表達人凝血因子、EPO的轉(zhuǎn)基因羊1998年獲得了能表達人BSA的轉(zhuǎn)基因奶牛2000年獲得了我國首例轉(zhuǎn)有人AAT的轉(zhuǎn)基因羊2005年研制的人乳鐵蛋白和人乳清BSA轉(zhuǎn)基因奶牛均獲得高效表達，含量分別達到3.4g/L和1.5g/L，標志了我國首次獲得可商業(yè)化生產(chǎn)的動物乳腺生物反應器重組人類蛋白當前第64頁\共有73頁\編于星期三\11點乳腺產(chǎn)品的缺點post-translationalmodificationshumanproteinC不能正確的形成亞基

humanantithrombinIII未能完全的糖基化當前第65頁\共有73頁\編于星期三\11點轉(zhuǎn)基因高等哺乳動物乳液蛋白糖基化仍有別于人，可能導致抗原性的變化。歐盟人用醫(yī)學制品委員會（CHMP）曾對ATryn上市提出過反對意見，理由是臨床例數(shù)太少。另外，美國Genzyme公司重組人酸性