生物大分子的分離純化技術(shù)第一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日生物樣品的常規(guī)分離純化方法透析微過濾鹽析冷凍干燥離心第二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日透析基本原理透析膜:

材料:火棉膠(Collodion),玻璃紙(Cellophane),纖維素(Cellulose)

纖維透析管的處理:1%乙酸水溶液1h,堿性EDTA(1%Na2CO3,1mMEDTA)煮1h,純水清洗,保存.透析液:

水,緩沖液,高分子的濃溶液Donnan效應(yīng):pH變化

(勤換透析液,使用大量的透析液)第三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日Donnan效應(yīng):第四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日微過濾的類型:深層濾器(DepthFilter):濾膜濾器(ScreenFilter):纖維素醋酸酯(硝酸酯)微過濾技術(shù)的應(yīng)用:溶液的澄清微量沉淀物的收集細(xì)菌細(xì)胞的收集微過濾第五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日鹽析基本原理：

在鹽濃度很低時，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶；隨鹽濃度不斷增加，蛋白質(zhì)的溶解度不斷降低而沉淀析出，即鹽析。鹽析實驗應(yīng)注意的問題：

鹽類的選擇：硫酸銨（767g/l,25℃)

鹽的飽和度：溫度：室溫或4℃pH：等電點蛋白質(zhì)的濃度：第六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日冷凍干燥基本原理：又稱升華干燥，是在低溫、副壓下進(jìn)行干燥的方法。冷凍干燥的條件：溫度，-10~-40℃；真空度，13~40Pa。第七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日離心基本原理種類：普通離心機(jī)（6000rpm)，高速離心機(jī)(25000rpm)，超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子：固定角度式，懸掛吊桶式第八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日離心(2)離心力和相對離心力(Relativecentrifugalforce)：

F=mω2r;Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r沉淀速度與沉降系數(shù)：

F摩擦=fvF凈=(Mp-Ms)ω2r-fv沉降系數(shù)：沉淀速度與離心力的比率（單位離心場中顆粒的沉降速度），蛋白質(zhì)\核酸\病毒等的沉降系數(shù)介于1×10-13到200×10-13秒的范圍.

以1×10-13s為一個單位,稱為斯韋德貝格單位(Svedberg)，用S(大寫)表示.

第九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日離心(3)離心技術(shù)的類型：

最大速度方法：

移動界面（MovingBoundary)超速離心法移動區(qū)帶(MovingZone)超速離心法

等密度方法(Iso-density)：第十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日臨床及生化分析樣品的預(yù)處理

樣品的類型、采集與保存酶樣品的準(zhǔn)備第十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日樣品的類型、采集與保存樣品的類型：第十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日樣品的類型、采集與保存樣品的采集血樣：

全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml)

血漿：2000g離心10min

血細(xì)胞：血清：5~30min自凝分離

尿樣：酸式采集（HCl或硼酸，pH<2.5)，堿式采集(碳酸鈉，幾滴苯酚抗菌）

唾液：

組織樣品：液氮等冷凍第十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日酶樣品的準(zhǔn)備酶活性的保持控制純化過程中的pH、溫度及有機(jī)試劑加入載體蛋白防止酶的吸附，如:BSA

加入輔助因子保護(hù)活性部位,如:EDTA,巰基乙醇，谷胱甘肽抑制蛋白酶的水解作用，如:氟代磷酸二異丙酯，甲（乙）酰-亮-亮-精三肽等親水分子穩(wěn)定劑，如甘油，糖醇等樣品制備從組織或器官制備樣品從組織或器官培養(yǎng)液中制備樣品從生物體液中制備樣品（5000rpm,15min)

從細(xì)胞培養(yǎng)液制備樣品第十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日電泳分離純化技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳高效毛細(xì)管電泳第十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日電泳分離純化技術(shù)基本原理

V=μeE(μe為電泳遷移率,即電場強(qiáng)度為1V/cm時的遷移速率.)影響電泳分離的因素:

物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì):

荷電性質(zhì),形狀

支持介質(zhì):吸附作用,電滲作用溶液介質(zhì):pH,離子強(qiáng)度電場強(qiáng)度:

常壓

500V第十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度和黏度等取決于凝膠的總濃度:第十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日聚丙烯酰胺凝膠電泳(2)凝膠電泳的裝置柱型(ColumnGel):10cm×6cm

板型(SlabGel):12cm×12cm或14cm×16cm;

玻璃板間距1.75或1.5cm.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(盤狀電泳)

電荷效應(yīng)濃縮效應(yīng)分子篩效應(yīng)第十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳第十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量

1%SDS+0.1M巰基乙醇分子量1.0×104~2.0×105蛋白質(zhì)的等電聚焦(IsoelectricFocusing,IEF)

原理

pH梯度的形成與保持

第二十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日瓊脂糖凝膠電泳特點：適合分子量大的分子；無毒；分辨率高；重復(fù)性好

膠濃度：0.5%~3%；分離1~9.0×107DNA片段

0.5~1.0%膠分離0.5~30kbDNA,

1.0~1.5%膠分離小片段第二十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶存在下酶切DNA片段的分析DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的鑒定DNA分子量的測定脈沖場凝膠電泳第二十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日DNA分子量的測定第二十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日高效毛細(xì)管電泳儀器第二十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日毛細(xì)管:I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm;L,0.1~1m進(jìn)樣系統(tǒng):nL~pL,流體力學(xué)方法和電動進(jìn)樣高壓直流電源：30kV,1~300μA

檢測

紫外-可見吸收法熒光檢測法電化學(xué)檢測法質(zhì)譜法第二十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日高效毛細(xì)管電泳基本概念：電泳淌度電滲流分析參數(shù)：淌度和遷移時間分離效率分離度第二十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日高效毛細(xì)管電泳分離模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)毛細(xì)管膠束電泳（CapillaryMicellarElectrokineticChromatography,CEKC)毛細(xì)管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis,CGE)毛細(xì)管等電聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF)第二十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日CGE的應(yīng)用DNA序列分析蛋白質(zhì)分析物理膠CZE第二十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日第二十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日第三十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日生物大分子的色譜分離純化技術(shù)排阻色譜親和色譜離子交換色譜反相及疏水作用色譜液－液分配色譜第三十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日第三十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期日親和色譜固定相

葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺－瓊脂糖混合凝膠，（與凝膠色譜相似）

配基：

分離抗體用抗原，半抗原分離酶