第三章第二節(jié)基因工程載體第一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一質粒載體

一、質粒的一般生物學特性二、質粒DNA的分離與純化三、質粒載體的構建及類型四、常用質粒載體舉例第二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一一、質粒的一般生物學特性（一）、質粒DNA1、質粒是細菌染色體外能夠自主復制的環(huán)形雙鏈的DNA分子。2、質粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。3、質粒DNA不僅能在細菌中復制，并且在添加真核復制信號和啟動子后，可以構建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應用廣泛。4、環(huán)形雙鏈的質粒DNA分子具有三種不同的構型：共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），開環(huán)DNA（ocDNA），線性DNA（cDNA），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開。第三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一第四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一（二）、質粒的拷貝數(shù)與不親和性1、質粒的拷貝數(shù)是指某種質粒在一個細菌細胞內的數(shù)目。根據(jù)每個寄主細胞中質?？截悢?shù)的多少，把質粒分為嚴緊型復制質粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復制質粒（拷貝數(shù)多，可達10-200份拷貝）。因此，作為載體的質粒應該是松弛型的。2、質粒的不親和性，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖構成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質粒稱為不親和質粒。第五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一二質粒DNA的分離與純化常規(guī)的方法:煮沸裂解法SDS裂解法堿裂解法第六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一三、質粒載體的構建及類型（一）質粒載體的發(fā)展概況；（二）質粒載體的特點（基本條件）；（三）遺傳標記基因（四）質粒載體的類型第七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一（一）發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。

第八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一（二）載體特點1、至少有一個復制起點2、

至少應有一個克隆位點。3、

至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。注：前三個特點必不可少。第九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一（三）遺傳標記基因1、標記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞這種指示可以是選擇性的（Ampr

，Tetr

，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα），絕大多數(shù)為后者。

**有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的—檢測性標記基因。有的基因是不能用作選擇性標記基因（lacZ等）。第十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一2、

標記基因的種類

1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr

，Tetr

，Cmlr，Kanr，Strr2）生化標記基因

其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ3、常用的遺傳標記基因及其作用機制

1)四環(huán)素抗性基因（Tetr

，Tcr）

Tetracycline可結合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質，與細菌細胞膜結合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。

2)氨芐青霉素抗性基因（Ampr

，Apr）

Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異地切割氨芐青霉素的β—內酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。第十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一3)氯霉素抗性基因（Cmlr

，Cmr）

Chlorophenicol可結合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素乙?；?，導致乙?；穆让顾夭荒芙Y合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內。第十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標記基因。

lacZ（lacZα）中含有多克隆位點，當無外源DNA片段插入時，質粒表達β—半乳糖苷酶的α-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼α-肽）表達的lacZ基因產(chǎn)物（β鏈）互補，產(chǎn)生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了lacZα-肽基因的結構，細菌內不能產(chǎn)生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀

b.

lacZα編碼5‘-端可容許很大的變化（如加入多克隆位點）而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大第十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一

PLacZαLacZβ

轉錄

翻譯

αβLacZ基因的結構與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組DNA分子轉化E.coli

外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子第十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一（四）、質粒載體的類型1、根據(jù)載體的分子生物學特性劃分

（1）.

質粒型載體:

環(huán)狀dsDNA分子，自主復制（2）.

病毒型載體:

環(huán)狀、線狀、ss-和ds-DNA分子，形成病毒顆粒（3）.混合型載體:

具質粒和病毒特性，特性的轉換依賴于宿主細胞生物學特性

第十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一2、根據(jù)載體功能劃分

（1）.普通型載體

(1)特點:至少有一個以上的克隆位點和兩個標記基因，其中一個用于轉化體選擇，另一個用于重組子檢測。

(2)用途:基因組或cDNA文庫的構建;亞克隆(subcloning)或限制酶譜分析；外源DNA擴增。例子:pBR322和pUC載體。

上述兩例中的非重組子來源有兩個：

a.

酶切反應時仍未被作用的pBR322或pUC18分子

b.酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子第十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一普通型載體pBR322的結構圖第十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一pUC18和pUC19載體第十八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一（2）、表達型載體（expressionvector）

1)

特點:

a.

基因的啟動子序列和終止子序列；

b.

一般無檢測標記基因；

c.

克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；

d.

重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。

2)

結構:

a.

轉化單元--宿主細胞轉化

b.

表達單元--外源基因表達

3)類型:

Ⅰ型：轉錄起始區(qū)（調控序列+啟動子）+終止子

Ⅱ型:轉錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)（核糖體結合序列和起始密碼子）+終止子

Ⅲ型:轉錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+終止子（常稱之為表達分泌型載體）第十九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一

顯然,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之,被表達的外源基因一旦確定,表達載體的類型也就確定了。

4)用途:a.

表達外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物

b.

用于構建cDNA文庫第二十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一三種表達型載體結構圖第二十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一四、常用質粒載體舉例1、pBR322載體2、pUC載體第二十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一1、pBR322載體優(yōu)點：1、分子量較小，為4363bp。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供轉化子的選擇記號。3、具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積1000-3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。第二十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一

BamHI片段(Tcr)

pBR322PstI(Apr)片段

重組分子I

重組分子Ⅱ(ApsTcr)(AprTcs）

PstI片段

外源DNABamHI片段重組分子I

涂布Ap平板

Apr轉化子

分別轉化E.coli(ApSTcS)重組分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr轉化子影印到Tc平板上AprTcS為重組子AprTcr為原載體

影印到Ap平板上ApSTcr為重組子即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程第二十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一2、pUC18和pUC19

pUC系列質粒載體具有三個顯著特點：（1）、分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素擴增，每個細胞含500-700個拷貝）。（2）、含易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZα，可利用-互補原理進行藍白篩選。（3）、多克隆位點區(qū)（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構成。每一種限制性內切酶會產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內切酶組合在質粒載體和外源DNA上產(chǎn)生相同的末端，進行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉移到M13mp載體，進行DNA測序和體外突變等研究。第二十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一pUC18和pUC19載體第二十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)（1）實驗對象（2）實驗性質（3）載體容量（4）合適克隆位點（5）載體的穩(wěn)定性（6）載體DNA制備的難易（7）外源基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點等第二