1．進行酶切用VspI對四種魚(GC、GS、NL和ZZ)基因組DNA(需基因組DNA濃度較高)進行酶切。TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"反應(yīng)體系為：ddH2O 15ALVspIbuffer 2PLVspI酶 1ALDNA 2AL總體積 20AL酶切在37°C反應(yīng)3?4h即可，但是為了提高酶切效率可切4?6h。PCR反應(yīng)程序為：94C5min,(94Clmin,53Clmin,72Clmin)X30,72ClOmin,4Chold。VspI酶即(AseI酶)：酶切識別位點為：5'AT；TAAT3'5'TAATfTA3'AseI酶的接頭為：Al：5'CTCGTAGACTGCGTACC3'A2：5'TAGGTACGCAGTC3'AseI酶用的預(yù)擴增產(chǎn)物為：A3：5'CTCGTAGACTGCGTACCTAAT3'2．接頭制備用10ALAl(200AM)和10ALA2(200AM)混合，94C3min后室溫放置30min。3．酶切片段與接頭連接接頭為Al和A2制備的接頭，命名為AE。連接反應(yīng)體系如下：ddH2O5ALT4ligation酶0.5ALT4buffer4AL酶切產(chǎn)物20ALATP(10mM)0.3ALAE1AL總體積30.8AL上述混合體系在16C連接過夜。10h左右。4?連接產(chǎn)物PCR擴增對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，每個樣本做4管。擴增引物為A3。反應(yīng)體系如下:ddH2O14AL10Xbuffer2.5ALMg2＋2ALdNTPs(10mM)0.5ALA3lALDNA(連接產(chǎn)物)5ALTaqE(2.5U/AL)0.2AL總體積25.2ALPCR反應(yīng)程序為:(94C30sec,56Clmin,72Clmin)X20,72ClOmin,4Chold。5.檢測擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物大小應(yīng)在750bp左右，即400?lOOObp較好。6．回收擴增產(chǎn)物將同一樣本的擴增產(chǎn)物收集于一個EP管中]向其中加入1/10總體積預(yù)冷的3MNaAC和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇

（或者等體積預(yù)冷的4MNHAC和2倍體積預(yù)冷的異丙醇）4—20°C放置30min（該步可在一20°C長期保存）室溫，12000rpm離心10min棄上清，加入1ml左右70%乙醇洗滌一次室溫，12000rpm離心5min棄上清，干燥后加入20ALddH2O溶解即可（可以根據(jù)沉淀量加入ddH2O）7．配雜交體系取250?500ng回收DNA與50?8Opmolbio-SSR探針混合，使SSC和SDS終濃度分別為4.2XSSC和0.07%SDS。具體雜交體系如下：ddH2O74.5AL20XSCC21AL10%SDS0.7AL回收產(chǎn)物3ALbio-SSR探針（AC）150.8AL總體積100ALPCR反應(yīng)程序為：95C5min,在58°C可以保存，但是不能時間長。在此過程中可以準備磁珠。bio-SSR探針序列可以為（AC）、（AC）、（AC）或者AG重復(fù)均可，這個可以根據(jù)基10 15 12因組序列確定。8．磁珠準備1） 2mgbeads（200^L）（根據(jù)DNA沉淀的多少決定所用磁珠的量，在100?200AL之間，在解凍磁珠時應(yīng)輕柔的上下顛倒，不能用力）放置在磁力架上，使其吸附到EP管的一側(cè)，然后從另一側(cè)吸棄清液，再加入1mLTEN100洗滌，輕柔顛倒混勻，使磁珠和TEN100充分混合2min左右，然后放到磁力架上吸附，如此反復(fù)3次即可。 '°°2） 用40ALTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。3） 為減少特異性吸附向上述混合液中加入2AL與之無關(guān)的基因組DNA（如植物基因組）。9．吸附1） 將雜交體系與稀釋的磁珠混合，再加入200ALTEN100稀釋。2） 室溫放置30min，期間輕柔混合（不能用力過猛，因為該過程是目的片段與探針吸附）。10?洗滌（去掉多余DNA和雜質(zhì)）將吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。D松弛型洗滌：400ALTEN1000洗滌3次，每次5min，加入TEN1000后輕柔混勻。2）嚴謹型洗滌：12ML20XSSC+12yL10%SDS+1176yLddH2O,400AL/次，洗滌3次，每次5min,其間需輕柔混勻。（使SSC終濃度為20%，SDS為0.1%）。11?洗脫1）第一次洗脫：在磁力架上棄上清液，向磁珠中加入50ALTE,95C5min后迅速取出將上清液吸入另一個管子中（若溫度降低那么則會復(fù)性），放入一20C保存。2） 第二次洗脫：向第一次洗脫后的磁珠中加入12AL0.15MNaOH,洗脫20min后，將其放在磁力架上，取一側(cè)清液，向清液中加入1.8AL1MHCL，再加入36.2ALTE，總共50AL后，放入一20°C保存。3） 洗脫產(chǎn)物回收：分別對兩次洗脫后的產(chǎn)物進行回收。分別向兩次洗脫后的產(chǎn)物加2MYtRNA,50AL預(yù)冷的4MNH4Ac以及100AL預(yù)冷的異丙醇，放入—20C30min以上（也可以長時間保存）。然后12000rpm離心1Omin后棄上清，（應(yīng)特別注意因為幾乎看不到沉淀，所以注意小心將弄丟），再加入70%乙醇洗滌一次，再12000rpm離心5min，棄上清。4） 將沉淀干燥后溶于20MLddH2O中。12．?dāng)U增洗脫后回收的產(chǎn)物擴增上一步中的回收產(chǎn)物，NL1st，NL2nd；GS1st和GS2nd各擴增4管。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O13.6AL10Xbuffer2ALMg2＋1.2ALdNTPs(10mM)0.4ALA30.8ALDNA（回收產(chǎn)物）2ALTaqE(2.5U/AL)0.2AL總體積20ALPCR反應(yīng)程序為:94C5min,（94C1min,53C1min,72C1min）X30,72C10min，4Chold。檢測擴增產(chǎn)物，最好在750bp左右，即400?1000bp均可。13?回收PCR擴增產(chǎn)物將所擴增的有目的帶的產(chǎn)物加入到一個EP管中，加入總體積1/10體積的3MNaAc和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇（也可以用等體積4MNH4Ac和2倍體積的預(yù)冷異丙醇，但是NH4Ac會去掉小片段，而NaAc不會），—20C放置30min以上室溫，12000rpm離心1Omin棄上清，加入1ml左右70%乙醇洗滌一次室溫，12000rpm離心5min棄上清，烘干后，沉淀溶于20^LddH2O中。14．與載體連接在EP管中配制連接混合液，總體積為10AL。PMD18-TVector0.5ALInsertDNA1ALddHO23.5PLLigationSolutionl5AL總體積10AL上述混合液在16C連接過夜。其中，PMD18-TVector用0.5?1AL均可，InsertDNA在0.1?0.3pmol,—般加入1AL,這些都根據(jù)DNA的量確定。LigationSolutionI應(yīng)在冰上溶解。15．連接產(chǎn)物的回收取出連接產(chǎn)物，向10AL反應(yīng)體系中加入2MYtRNA+12AL預(yù)冷的4MNH4Ac+24AL預(yù)冷異丙醇，混勻后一20°C沉降30min以上。（YtRNA的作用是幫助沉淀，因為連接產(chǎn)物較少所以要加入助沉劑YtRNA）室溫，12000rpm離心1Omin棄上清，加入500AL（根據(jù)DNA量多少加）70%乙醇洗滌一次室溫，12000rpm離心5min棄上清，烘干后，沉淀溶于5ALddH2O中。16．電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化杯和電轉(zhuǎn)化細胞在冰上預(yù)冷。1.向每管連接產(chǎn)物回收液中加入50AL電轉(zhuǎn)化細胞，用槍混勻放在冰上。2．把混合液加入電轉(zhuǎn)化小杯中心的孔隙中，放到冰上。用紙擦干小杯，用1500V電壓在電轉(zhuǎn)化儀上進行電擊（電擊時間長短是根據(jù)DNA量確定的，機器自己會控制）。轉(zhuǎn)化后，每個小杯中加入900AL液體LB（不加氨芐），用槍頭吹打以便使其和轉(zhuǎn)化細胞混勻。5?取出所有液體加入1.5mLEP管中，170rpm,37C搖1h。6?清洗電轉(zhuǎn)化小杯，避免接觸金屬面，分別用ddHp70%乙醇和無水乙醇各清洗3次。7.取出搖好的菌液后，適當(dāng)稀釋涂板，30AL菌液+370AL液體LB,然后涂2個板子，每個板子200AL。在37C培養(yǎng)過夜。接頭序列：ATTAGGTACGCAGTCTACGAGCTCGTAGACTGCGTACCTAAT5B：AATGGGAAAGGCACAACTACAAGTCCCAGAATGCAAAGTGCTGTTGGCTAAAAAGCCAGGATTGGCTGAAGGTGTCACACATGACATGGGGCCACTTGGCAGTTTAGCACAGCTCCGAAAAGGGCTTTTGGTGCCAAGGATGGGTATTCCTCTGAGAACATTTGTGCCTGAATTTTGGCGAAAAGTACCCCTGGTCAGAGCTACAGAGCTGGTGTGTGAACTGCCCTGGTGAACGTTTCATCTCTACTCTGCACCACATAGTGGCTGGGGTTTTCCCCACACTTTTTACTCAGTGCAACATTAGCCTTGTGATTTGTTTTTCTCAGTAGTGTAAAAACACAGTTCTTCAGATTCCAGGTTGCTTCACTTGTGGTTGTTCCTCTGCTCCCTGGTGACTTTGCTTAGAAGCTCCAGTATTACAAAGATTGTACATGCACCTCTATCTAGCCCTCTTTGTTCCTCTACTGATGTTTTTCTGTTGGTGTCTCACTTGATCTGTCTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCATCACTCTCTTTCTCCAGCATCATACTTGCTCACTCCACAAATCCTCCCATCTCTCTCTCACACAGTCTCTCTCCCTCTCTCAATCTGTCTTTTTTTTTGTGGTGTTTTGACGCGTGCATGA

CCCCAAGATTGGGGTATCGGCCAGCGCAGTTTAA矗qi閨meMotifNo.ofSSRerkl5B-1tc11606527604RatingSe<|HoLeiij[|tliTmPC]GC4oAG^calsJtnol]Activity【陽4D]Sense100352055.3EM-37.23=5.1Aiiti-sense100230?055.350.0-37.?31.2Product88—19GS5.544%--―HairpinDimerFalsePrimingCross：DimerNoHairpinsFoliikISenseNoneNoneNoneFoundAiiti-senseNoneNoneNonePl：5'CTCCCTGGTGACTTTGCTTA3'P2：5'GATGGGAGGATTTGTGGAGT3'SsrttPrimer5.0微衛(wèi)星分子標記篩選方法綜述摘要：微衛(wèi)星是一種短的串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR)或簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,SSR)。它作為一種重要的分子遺傳標記，能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化，被廣泛應(yīng)用于實驗動物的研究。本文概述了獲得和富集微衛(wèi)星位點的常用方法。最簡便、最省時的方法是從從公共數(shù)據(jù)庫(如Genbank、EMBL、EST數(shù)據(jù)庫等)或已發(fā)表的文獻中查找到微衛(wèi)星位點，但只限于已經(jīng)有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種；第二種方法是種間轉(zhuǎn)移擴增，即從相近物種的數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點，或使用已有數(shù)據(jù)發(fā)表的遺傳距離相近物種的微衛(wèi)星標記。第三種方法是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點，其中用于富集微衛(wèi)星的方法有引物法、磁珠雜交法、尼龍膜雜交法以及分子標記技術(shù)法。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星；分子標記；實驗動物微衛(wèi)星(Microsatellite),又稱為簡單序列重復(fù)(SimpleSequenceRepeat,SSR)，短串聯(lián)重復(fù)(ShortTandemRepeatSTR),是以少數(shù)幾個核苷酸(一般1?6個)為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)DNA序列。微衛(wèi)星位點廣泛分布于真核生物的基因組中［1］，在植物基因組中平均每33Kb存在一個20bp長的微衛(wèi)星位點，而在哺乳動物中每6Kb存在一個20bp長的微衛(wèi)星位點［2］。并且SSR的重復(fù)次數(shù)不同和重復(fù)程度不同，使其呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。微衛(wèi)星標記共顯性的特點使它能夠用于研究等位基因，區(qū)分二倍體(或多倍體)的純合體或雜合體，這是AFLP、RAPD等顯性標記所無法做到的。另外，微衛(wèi)星的特異性引物擴增具有良好的重復(fù)性和保真性，方便各實驗室間的交流。目前，微衛(wèi)星標記已被廣泛應(yīng)用到基因連鎖與遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、譜系和發(fā)育研究、疾病檢測以及品種鑒定、親本分析與個體、純系檢驗上。隨著微衛(wèi)星標記在圖譜上的豐富,將顯現(xiàn)出更大的優(yōu)勢。但微衛(wèi)星分析中引物的獲得需要預(yù)先獲知核酸序列,其廣泛應(yīng)用受限于從特定的物種中分離微衛(wèi)星位點的難度和花費。微衛(wèi)星標記分離最大的困難是引物的獲得。同RAPD、AFLP等遺傳標記不同，微衛(wèi)星研究首先需要獲知位點的序列信息，以便從重復(fù)序列兩端側(cè)翼的保守序列中設(shè)計引物。因而微衛(wèi)星引物的開發(fā)是應(yīng)用該技術(shù)的關(guān)鍵。目前已知微衛(wèi)星位點的物種很有限，這是因為微衛(wèi)星位點的獲得需經(jīng)過克隆、雜交篩選、測序等步驟，因此需花費一定的人力、金錢，這限制了微衛(wèi)星標記的大量使用。但近年來發(fā)展起來的各種微衛(wèi)星位點富集技術(shù)已在一定程度上解決了這個問題。已有的最常用的獲得微衛(wèi)星位點的方法包括：1.從公共數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點；2?遺傳距離相近物種間引物轉(zhuǎn)移擴增；3?從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點。其中，最方便、最經(jīng)濟的方法就是從已發(fā)表的文獻中獲得微衛(wèi)星引物，但該法在使用對象上，只限于已有引物開發(fā)出的物種，而且引物的數(shù)量不會有所增加，只能停留在原有基礎(chǔ)上。對于近緣種引物的應(yīng)用，其適用范圍究竟有多大；原物種的微衛(wèi)星基因座在其他物種間轉(zhuǎn)移擴增時，其多態(tài)性如何。這些問題使得在不同物種間共用微衛(wèi)星引物時，盲目性較大，可指導(dǎo)操作的理論依據(jù)不足。最好的途徑就是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點并進行引物的開發(fā)。從數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點在上述三種方法中,最簡便最省時的就是從公共數(shù)據(jù)庫或已發(fā)表的文獻中查找到微衛(wèi)星位點。許多微衛(wèi)星研究的出發(fā)點都是公共數(shù)據(jù)庫，比如從EMBL、Genbank或EST數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點。從這些數(shù)據(jù)庫中，可通過電子查詢方式方便地獲得所需要的序列或?qū)ふ乙汛嬖诘奈⑿l(wèi)星引物。研究者對大量序列進行處理，利用ClustalW等程序，根據(jù)相似性程度，剔除冗余的EST，再剔除過短的序列（小于lOObp）和過長的序列（大于lOOObp）,再利用SSRHunter等軟件搜索獲得含有微衛(wèi)星的序列，并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計引物。何蔚［3］等選用前人分離得到的42對大熊貓微衛(wèi)星引物，分別用圈養(yǎng)大熊貓的血液DNA和野生大熊貓的糞便DNA對其進行PCR擴增，結(jié)果表明不同標記的多態(tài)性差異較大，并篩選出13對能較好地應(yīng)用于大熊貓遺傳多樣性研究的微衛(wèi)星引物?？飫倶颍?］等利用生物信息學(xué)方法從公開發(fā)表的鱖魚GenBank數(shù)據(jù)庫中尋找多態(tài)信息含量豐富的微衛(wèi)星位點中共搜索到304條鱖魚核酸序列，經(jīng)計算機篩選和人工選擇,最終獲得22條含微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列，利用SSRHunter軟件在此22條含有微衛(wèi)星的序列中發(fā)現(xiàn)30個微衛(wèi)星位點，設(shè)計出17對引物，其余位點兩端序列短無法設(shè)計引物。其中13對引物擴增條帶清晰，經(jīng)過多態(tài)性分析，最終篩選獲得6對多態(tài)性微衛(wèi)星引物。徐玲玲⑸等從資料和GenBank中選取擴增效果好、等位基因多、均勻分布于小型豬18條常染色體和X染色體上的100個微衛(wèi)星位點合成引物，對封閉群小型豬基因組進行PCR擴增及條件優(yōu)化，篩選出32個分布于不同染色體且等位基因多的微衛(wèi)星位點。近年來隨著數(shù)據(jù)庫中EST序列的增加，通過數(shù)據(jù)庫搜尋法獲得EST微衛(wèi)星位點的報道越來越多。在此基礎(chǔ)上進行SSR引物開發(fā)也就成了一種既經(jīng)濟又有效的方法。許新⑹等從雜色鮑cDNA文庫中用SSRHunter軟件搜索獲得173個重復(fù)序列，從中設(shè)計93對引物，有78對可以擴增，占合成總引物的83.9%，用深圳、汕尾等3個群體中挑選出多態(tài)性引物19對，多態(tài)性微衛(wèi)星比例24.36%。石耀華⑺等從馬氏珠母貝cDNA文庫查找到了268個重復(fù)序列，含微衛(wèi)星的EST數(shù)占EST總數(shù)的3.48%，設(shè)計151對微衛(wèi)星引物，有130對可以擴增，占合成引物總數(shù)的86.09%，其中多態(tài)性引物45對，占微衛(wèi)星總數(shù)的34.6%。EST微衛(wèi)星位于編碼區(qū)，由于基因序列的保守性，EST微衛(wèi)星序列比從基因組中篩選的微衛(wèi)星多態(tài)性低°Eujayl⑻比較了小麥EST的微衛(wèi)星和基因組微衛(wèi)星多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組微衛(wèi)星多態(tài)性（53%）遠高于EST微衛(wèi)星（25%）。從數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星最大的缺點是只限于已經(jīng)有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種。一個替代方法是從相近的物種數(shù)據(jù)庫中查找微衛(wèi)星位點，或使用已發(fā)表的遺傳距離相近物種的微衛(wèi)星標記。近緣物種交叉擴增獲得微衛(wèi)星引物由于微衛(wèi)星重復(fù)序列和包含引物位點的側(cè)翼序列在物種間具有保守性，所以某一個物種的微衛(wèi)星引物可以在其相近的物種中使用，用來檢測相近物種同源位點的多態(tài)性。這樣就大大地減少了檢測微衛(wèi)星位點的工作量。微衛(wèi)星在近緣種之間的通用性已有研究,但在屬間應(yīng)用還不多。根據(jù)M.Rossetto［9］對近年來發(fā)表文獻的總結(jié)，微衛(wèi)星位點可在物種間擴增，其多態(tài)性也相當(dāng)高。Zucoloto［10］等利用密西西比鱷和寬吻凱門鱷的微衛(wèi)星在其他3種鱷魚中進行擴增，擴增率均在85%以上。Kupper［11］等使用的環(huán)頸鸻微衛(wèi)星成功地在4種鸻科鳥類中獲得擴增，平均擴增率為75%。蔡清秀［12］等從從非洲象31個微衛(wèi)星位點和5個已知亞洲象微衛(wèi)星位點中篩選出14個勐養(yǎng)亞洲象的微衛(wèi)星位點，其中9個多態(tài)位點能在185份糞便樣品DNA中穩(wěn)定擴增。孫濤［13］等利用138條人類微衛(wèi)星引物在黑葉猴中進行篩選，得到了23個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點。其中有7個位點偏離Hardy-Weinberg平衡，9個位點存在無效等位基因現(xiàn)象，但是各位點之間均未檢測到連鎖不平衡現(xiàn)象，這些位點將在黑葉猴種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮重要作用。洪艷云［14］等選用10對非洲糜羚微衛(wèi)星引物和10對綿羊微衛(wèi)星引物作為篩選普氏原羚基因組DNA微衛(wèi)星位點的引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20對引物中有8對引物在普氏原羚基因組DNA中擴增出了多態(tài)性位點。 譚元卿［15］等利用小鼠微衛(wèi)星位點引物536對，對長爪沙鼠基因組DNA擴增出了313個陽性條帶，經(jīng)測序分析確定130個長爪沙鼠的微衛(wèi)星位點，與小鼠同源性為24.3%。引物跨物種共用的有效程度除與其親緣關(guān)系的遠近有關(guān)外。Primmer［16］等對大量鳥類微衛(wèi)星交叉擴增研究的數(shù)據(jù)進行總結(jié)后提出，交叉擴增中微衛(wèi)星在來源物種中的完全重復(fù)單元數(shù)目(perfectrepeatunits)與交叉擴增所獲得的同源微衛(wèi)星位點的多態(tài)性呈正相關(guān)。微衛(wèi)星位點的重復(fù)單元數(shù)目越多，其多態(tài)性也就越高，這表明微衛(wèi)星位點的高重復(fù)單元數(shù)目在其近緣物種仍有所保持。這意味著即使由于較遠的親緣關(guān)系使物種間交叉擴增率較低，具有較高重復(fù)單元數(shù)目的原始微衛(wèi)星位點仍有可能獲得有價值的擴增產(chǎn)物。值得注意的是，僅從產(chǎn)物片斷大小和變化上不是總能很好地確定微衛(wèi)星的存在，通過改變擴增條件用微衛(wèi)星引物在物種間擴增得到產(chǎn)物后，仍需要通過雜交、測序等方法確定所擴增出的條帶就是所期望的產(chǎn)物。從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點對于無法從上面兩種方法獲得微衛(wèi)星引物的物種，可以從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點。絕大多數(shù)微衛(wèi)星位點是從100-1000bp的小插入片段基因組文庫中通過寡核苷酸探針雜交獲得的。標準的分離微衛(wèi)星位點的方法有如下步驟：①提取基因組DNA；②用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切割成小片段；③凝膠電泳，回收大小100-1000bp的片段；④將回收片段克隆，使用標記探針進行雜交；⑤篩選出含有重復(fù)序列的克?。虎逌y序證實重復(fù)序列片段的存在；⑦根據(jù)重復(fù)序列片段兩端保守序列設(shè)計引物，進行PCR擴增,檢驗引物的有效性；⑧對小量樣本進行預(yù)試驗,挑選出重復(fù)性好，具多態(tài)性的微衛(wèi)星位點。按以上步驟，Srikwan［17］和Munshi-South［18］利用尼龍膜菌落原位雜交法分離出6個泰國樹鼩(Tupaiaglis)和5個馬來西亞樹鼩(Tupaiaspp.)的微衛(wèi)星位點。魏東旺［19］等從鯉魚基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點，用探針(CA)n對質(zhì)粒pGEM-3Zf(+)構(gòu)建的基因文庫進行雜交篩選，從2000個白色菌落中共獲得陽性克隆45個，其中32個克隆中共得到22個微衛(wèi)星。從基因組文庫中分離微衛(wèi)星位點的傳統(tǒng)方法在微衛(wèi)星富集程度上效率很低，為了提高微衛(wèi)星位點分離的效率，在文庫構(gòu)建前或構(gòu)建后發(fā)展了一些富集方法。3.1雜交法富集微衛(wèi)星雜交富集法根據(jù)所使用的介質(zhì)不同可分為三種：磁珠法、尼龍膜法和親和素超濾離心法。磁珠富集法磁珠富集法的基本原理是用生物素標記重復(fù)序列寡核酸探針并與基因組DNA酶切片段雜交，再利用生物素與親和性強的特性，使兩者相互作用的穩(wěn)定性和強度即使在變性、雜交、洗脫等操作過程中也不產(chǎn)生分離，從而完成對重復(fù)序列目標片段的富集，建立微衛(wèi)星富集文庫。經(jīng)過磁珠富集后使獲得的具有重復(fù)序列片段的效率大幅度提高。目前，鏈親和素包埋的磁珠已被廣泛應(yīng)用到各種微衛(wèi)星富集方法中。磁珠雜交的微衛(wèi)星富集過程是在文庫構(gòu)建前，一般步驟如下：限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA片段＜1000bp；接頭連接酶切DNA片段；酶切位點和接頭作為引物結(jié)合位點，進行擴增，增加DNA片段量；生物素標記的互補微衛(wèi)星寡核酸探針同PCR擴增產(chǎn)物雜交；鏈霉素包埋的磁珠雜交篩選目的片段；目的片段洗脫、擴增、純化、克??；陽性克隆進行DNA測序，設(shè)計引物進行PCR分析；多態(tài)性鑒定。于穎［20］等通過磁珠富集法構(gòu)建了藏雞基因組微衛(wèi)星富集文庫，從1200個轉(zhuǎn)化子中獲得了353個陽性克隆，隨機挑選53個測序，根據(jù)測序結(jié)果成功設(shè)計了18對藏雞微衛(wèi)星引物，最終篩選出6個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記。袁慧［21］等用磁珠富集法構(gòu)建了巖原鯉AC重復(fù)和GATA重復(fù)的微衛(wèi)星富集文庫，陽性克隆率分別為30%和7%左右。對40個AC重復(fù)的陽性克隆和30個GATA重復(fù)的陽性克隆測序，共獲得61個微衛(wèi)星序列。朱亮［22］等法應(yīng)用磁珠和生物素標記的微衛(wèi)星探針與豚鼠基因組酶切片段雜交，捕獲200-1000bp含有微衛(wèi)星序列的DNA片段，克隆構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的小片段插入文庫然后用PCR法進行篩選，結(jié)果從約2000個轉(zhuǎn)化子中獲得240個陽性克隆對其中98個進行了測序，并成功設(shè)計豚鼠微衛(wèi)星引物17對。WANG［23］等采用磁珠富集法建立黑斑狗魚微衛(wèi)星富集文庫，然后利用Y-32P標記的放射性同位素探針進行第二次雜交，得到的陽性克隆為1300個，占87.25%，從中挑出196個進行測序，192(97.96%)個含有微衛(wèi)星序列。趙亮［24］等為促進大銀魚保護遺傳學(xué)的開展，采用磁珠富集微衛(wèi)星序列技術(shù)，提高了微衛(wèi)星位點的篩選效率，成功獲得6個具有多態(tài)性的(CA)n重復(fù)序列的大銀魚微衛(wèi)星位點。李齊發(fā)［25］等用鏈親和素磁珠親和捕捉與生物素標記的微衛(wèi)星寡核苷酸探針(CA)12、(CCG)8、(CAG)8、(TTTC)8退火結(jié)合的含有接頭和牦牛微衛(wèi)星序列的單鏈限制性酶切片段，首次成功構(gòu)建牦?；蚪M微衛(wèi)星富集文庫。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性克隆率為77%(37/48)，說明構(gòu)建的牦牛基因組微衛(wèi)星富集文庫是一個高質(zhì)量的文庫。閆守慶［26］等將貉基因組DNA酶切片段與MboI連接頭連接，連接產(chǎn)物與生素物標記的(AC)n微衛(wèi)星探針變性及退火，再通過鏈親和素偶聯(lián)磁珠親和捕捉，經(jīng)吸附、洗滌、洗脫、PCR擴增，連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫，經(jīng)測序分析表明該文庫含重組克隆約2800個，陽性克隆71.4%。李新國［27］等以日本扁柏4個種源的DNA樣品為材料，與含有生物素標記的(CT)15探針雜交，再用磁珠富集雜交產(chǎn)物，成功地實現(xiàn)了日本扁柏核基因組微衛(wèi)星的高效分離，共獲得2200多個陽性克隆，發(fā)現(xiàn)含有微衛(wèi)星的克隆比例高達65.6%。尼龍膜富集法尼龍膜法的主要步驟包括限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA；接頭連接；通過吸附在尼龍膜上的許多微衛(wèi)星探針來富集基因組中的微衛(wèi)星片段；洗脫結(jié)合片段，用接頭作為引物進行；目的片段連接到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆測序。戰(zhàn)愛斌［28］等應(yīng)用微衛(wèi)星富集文庫一菌落原位雜交法，用固定了(AG)15和(AC)15探針的尼龍膜(HybondN+)捕捉含有微衛(wèi)星DNA的片段，經(jīng)洗脫、PCR擴增和TA克隆，構(gòu)建櫛孔扇貝的微衛(wèi)星富集文庫。富集文庫中1200個重組克隆經(jīng)過菌落原位雜交后，532個(44.3％)為陽性克隆。任意挑選100個克隆測序，結(jié)果顯示所有的克隆都至少含有一個微衛(wèi)星位點。3.1.2親和素和超濾離心富集法親和素超濾離心法的一般過程如下：限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA片段＜1000bp；接頭連接酶切DNA片段；酶切位點和接頭作為引物結(jié)合位點，進行擴增，增加DNA片段量；生物素標記的互補微衛(wèi)星寡核酸探針同PCR擴增產(chǎn)物雜交；用親合素捕獲并超濾離心濃縮富集雜交的目的片段；以富集的核酸作為模板，反應(yīng)體系和程序同前進行PCR擴增；PCR產(chǎn)物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴增；擴增產(chǎn)物克??；陽性克隆進行DNA測序，設(shè)計引物進行PCR分析；多態(tài)性鑒定。李石柱［29］等應(yīng)用湖北釘螺基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交，親合素捕獲并超濾離心濃縮富集、克隆并測序，獲得湖北釘螺微衛(wèi)星DNA序列205條，GenBank注冊登記號GU204044-GU204248。張麗［30］等應(yīng)用中華白蛉基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大后克隆并測序，獲得118條微衛(wèi)星序列，重組克隆陽性率為78.6%。樊勇［31］等應(yīng)用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大，克隆并測序，獲得252條序列，GenBank注冊登記號為EF620047-EF620298。馬雅軍［32］等對雷氏按蚊的微衛(wèi)星DNA序列進行了分離，應(yīng)用雷氏按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交,親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大后克隆并測序,獲得雷氏按蚊微衛(wèi)星DNA58條，GenBank注冊登記號為EF620299-EF620356。引物法富集微衛(wèi)星引物法富集微衛(wèi)星一般是使用同目的微衛(wèi)星重復(fù)互補的寡核苷酸作為引物，通過PCR反應(yīng)在文庫構(gòu)建前或構(gòu)建后富集微衛(wèi)星位點。根據(jù)所使用引物類型的不同可分為兩類：引物序列同微衛(wèi)星寡核苷酸互補以及簡并性寡核苷酸引物。Paetgkau［33］用