蛋白質(zhì)分離純化和表征第一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一第7章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征

p290一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則五、蛋白質(zhì)的分離純化方法六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定七、蛋白質(zhì)性質(zhì)小結(jié)（補充）第二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子由氨基酸組成，在蛋白質(zhì)分子中保存著游離的α-氨基和α-羧基及側(cè)鏈上的各種功能團，所以其物理化學(xué)性質(zhì)有些與氨基酸相同。

蛋白質(zhì)也是一類兩性電解質(zhì)，能和酸或堿發(fā)生作用。在蛋白質(zhì)分子中，可解離基團主要來自側(cè)鏈上的功能團，這些基團能解離為帶電基團，從而使蛋白質(zhì)帶電荷。第三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一

在酸性情況下，蛋白質(zhì)中的各堿性基團接受質(zhì)子，使蛋白質(zhì)帶正電荷；

在堿性情況下，蛋白質(zhì)中的各酸性基團解離出質(zhì)子，使蛋白質(zhì)帶負電荷。

在某一pH值時，白質(zhì)所帶的正電荷與負電荷恰好相等，即凈電荷為零，此時溶液的pH值就是蛋白質(zhì)的等電點。

每種蛋白質(zhì)都有它特有的等電點，這也是鑒別蛋白質(zhì)的指標之一。等電點和蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸的種類有關(guān)中性堿性酸性。第四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)的酸性氨基酸和堿性氨基酸含量與等電點的關(guān)系

蛋白質(zhì)酸性氨基酸每摩爾殘基數(shù)堿性氨基酸每摩爾殘基數(shù)堿性/酸性等電點37胃蛋白酶60.21.0血清蛋白血紅蛋白核糖核酸酶82991.24.753881.76.77202.99.5第五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀

(一)根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量

(二)滲透壓法測定相對分子質(zhì)量（三)蛋白質(zhì)的擴散和擴散系數(shù)

(四)沉降分析法測定相對分子質(zhì)量

(五)凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量

(六)SDS酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量

(七)蛋白質(zhì)分子的形狀第六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一

(一)根據(jù)化學(xué)組成

測定最低相對分子質(zhì)量

用化學(xué)分析方法測定出蛋白質(zhì)某一微量元素（如鐵）的含量，并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只有一個鐵原子，則可計算出蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。例肌紅蛋白含鐵量為0.335%，其最低相對分子質(zhì)量可按下式計算:

鐵的原子量最低相對分子質(zhì)量=×100

鐵的百分含量

=(55.8/0.335)×100=16700

注：真實的Mr(相對分子質(zhì)量)為最低相對分子質(zhì)量的n倍(n=1，2，3…

…)第七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一(二)滲透壓法測定相對分子質(zhì)量

滲透壓:為了制止溶液與純?nèi)軇┲g的凈移動所需施加于溶液的壓力，它是單位體積內(nèi)溶質(zhì)質(zhì)點數(shù)的函數(shù)，與溶質(zhì)的性質(zhì)和形狀無關(guān)。

優(yōu)點:

所用實驗裝置簡單準確度不亞于其他方法

缺點:蛋白質(zhì)的滲透壓受PH影響，只有蛋白質(zhì)分子處于等電點時，測定的滲透壓才不受緩沖液中無機離子的影響。需要純品。P292圖7-1第八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一

蛋白質(zhì)的相對分子量可以直接用沉降系數(shù)表示。一般把單位離心場里的沉降速度稱為沉降系數(shù)。

沉降系數(shù)

用s表示。一個s單位：為1×10-13秒,8×10-13秒用8s表示。

超速離心機最初是Svedberg于1940年設(shè)計制造的。沉降分析法測定相對分子質(zhì)量第九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一（1）沉降速度法

把蛋白質(zhì)樣品放在離心機中，在離心力的作用下，蛋白質(zhì)分子沿旋轉(zhuǎn)中心向四周移動，并產(chǎn)生沉降界面，界面的移動速度代表蛋白質(zhì)的移動速度。在界面處由于濃度差造成折射率不同，可借助適當?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)，分析計算蛋白質(zhì)的分子量。

第十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一

利用沉降平衡法測定分子量是在較低速度的離心力場進行的。以較低速度較長時間離心，使擬分析的物質(zhì)沉降與擴散間達到平衡，離心期間不形成界面，只表現(xiàn)濃度梯度曲線的曲率。離心開始時，分子顆粒發(fā)生沉降，由于沉降的結(jié)果造成濃度梯度，因而產(chǎn)生分子擴散作用，擴散力的作用方向和離心力相反。

（2）沉降平衡法第十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

與蛋白質(zhì)的沉淀

(一)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

(二)蛋白質(zhì)的沉淀第十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一(一)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)是高分子化合物，由于相對分子質(zhì)量大，它在水溶液中所形成的顆粒具有膠體溶液的特征如布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜以及具有吸附能力等。

利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等來分離純化蛋白質(zhì)，這個方法稱為透析法。

第十三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)溶液是膠體溶液（如血清、蛋清）膠體條件：

1.大?。?-100nm2.有水膜：表面有許多極性、親水基團(-NH3、-COOH、-OH、-SH、-CONH2等）。

3.帶相同的電荷（同性相斥）第十四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一(二)蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)

如果在蛋白質(zhì)溶液中加入適當?shù)脑噭?，破壞了蛋白質(zhì)的水膜或中和了蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)膠體溶液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。蛋白質(zhì)可因加入下列試劑而產(chǎn)生沉淀。

1、加高濃度鹽類

2、加有機溶劑

3、加重金屬鹽

4、加某些酸類或生物堿試劑

5、加熱變性沉淀第十五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一加高濃度鹽類

硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等可以破壞蛋白質(zhì)膠體周圍的水膜，同時又中和了蛋白質(zhì)分子的電荷，因此使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象，稱為鹽析。鹽析法是分離制備蛋白質(zhì)的常用方法。根據(jù)各種蛋白質(zhì)的顆粒大小、親水性的程度不同，在鹽析時需要鹽的濃度也不一致。因此，這種調(diào)節(jié)中性鹽的濃度使蛋白溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出的方法稱分段鹽析法。

第十六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一加有機溶劑

酒精、丙酮等可使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這是由于這些有機溶劑和水有較強的作用，破壞了蛋白質(zhì)分子周圍的水膜，因此發(fā)生沉淀反應(yīng)。第十七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一加重金屬鹽

氯化高汞、硝酸銀、醋酸鉛及三氯化鐵等，因為蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負離子，可與這些重金屬的正離子作用而生成不易溶解的鹽而沉淀。堿性條件下第十八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一加某些酸類或生物堿試劑

酸性條件下

加苦味酸、單寧酸、三氯乙酸等能和蛋白質(zhì)化合成不溶解的蛋白質(zhì)鹽而沉淀。生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，如鞣酸、苦味酸、碘化鉀等。酸性條件下第十九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一加熱變性沉淀

幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量的鹽類促進蛋白質(zhì)加熱凝固。當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，加熱凝固最完全最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原因可能是由于熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞了水化層。第二十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一五、蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化依據(jù)（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法（三）根據(jù)電荷不同的純化方法（四）利用選擇性吸附的純化方法第二十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1、透析和超過濾：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜而與小分子分離。

2、密度梯度離心：蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成不同的區(qū)帶。

3、凝膠過濾第二十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一凝膠過濾：即分子排阻層析。凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大分子最先流出層析柱。大分子

小分子葡聚糖小株第二十三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一（二）利用溶解度差別的純化方法1、等電點沉淀和PH過濾2、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析：中性鹽在低濃度時可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強；當離子強度增大到足夠高時，此時與蛋白質(zhì)疏水基團接觸的自由水被移去以溶化鹽離子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水基團暴露，使蛋白質(zhì)因疏水作用凝聚沉淀，即鹽析。3、有機溶劑分級分離法：一是降低介質(zhì)的介電常數(shù)，二是與蛋白質(zhì)爭奪水膜水。4、溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：低溫穩(wěn)定，高溫不穩(wěn)定。在0~40℃，大部分球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增加。第二十四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一

一、測定含量方法：

1.凱氏定氮法：靈敏度較低

2.雙縮脲法0.21.7mg/L；

3.Folin-酚法（Lowry法）：25g250g/ml4.紫外吸收法、染料結(jié)合法和膠體金測定法等。二、測定純度方法：

六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定第二十五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一樣品量0.21.7mg/L；雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。將尿素加熱到180℃，則兩分子尿素縮合成一分子雙縮脲，并放出一分子氨。

雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)和物，此反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)

雙縮脲法第二十六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍色化合物，將其與雙縮脲法結(jié)合起來，蛋白質(zhì)形成兩種顏色的混合物老綠色，在650nm具有特定的吸收。

Folin-酚法（Lowry法）第二十七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一考馬斯亮藍法（Bradford法）

考馬斯亮藍G250是一種帶有負電荷的染料，在酸性條件下，可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，形成藍色化合物，在595nm具有特定吸收，反應(yīng)簡便、快速、靈敏度高，550g/ml。

第二十八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一

由于核酸在260nm具有光吸收，對測定干擾較大，可采用280nm、260nm同測法。

蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）＝1.45A280-0.74A260

紫外吸收法第二十九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一（二）蛋白質(zhì)純度鑒定

純度和分子量的測定：采用電泳（如聚丙烯酰胺凝膠電泳，梯度凝膠電泳等）、高速離心、分子篩層析、高效液相色譜等技術(shù)測定。等電點的測定：利用等電聚焦方法測定。亞基個數(shù)的測定：采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定。第三十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一加入的固體的蛋白質(zhì)的量溶解的蛋白質(zhì)的量恒定濃度法鑒定蛋白純度純的蛋白一個拐點第三十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一七、蛋白質(zhì)性質(zhì)小結(jié)1、蛋白質(zhì)的分子量2、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點3、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)4、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)5、蛋白質(zhì)的變性6、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)(補充）第三十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)的變性

天然蛋白質(zhì)分子受到某些物理因素如：熱、紫外線、高壓和表面張力或化學(xué)因素的作用時，生物活性喪失，溶解度降低，不對稱性增高以及其他的物理化學(xué)因素發(fā)生改變，這