課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的別離與計數(shù)第一頁，共三十五頁。整理ppt一、課題背景1、尿素的利用

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O第二頁，共三十五頁。整理ppt4、課題目的①從土壤中別離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌第三頁，共三十五頁。整理ppt一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照第四頁，共三十五頁。整理ppt1、實(shí)例：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒错懯且环N在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫〔930C〕的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株第五頁，共三十五頁。整理ppt2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。也就是用選擇性培養(yǎng)基篩選。第六頁，共三十五頁。整理ppt15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的別離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②從用途看此培養(yǎng)基屬于哪類？③從化學(xué)成分看此培養(yǎng)基屬于哪類？選擇培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第七頁，共三十五頁。整理ppt15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的別離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素第八頁，共三十五頁。整理ppt15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的別離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：③此培養(yǎng)基是否對微生物具有篩選作用？如果有，是如何進(jìn)行篩選的？有，此培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。第九頁，共三十五頁。整理ppt6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是判斷該培養(yǎng)基有選擇性實(shí)驗(yàn)組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

結(jié)果只生長分解尿素細(xì)菌生長多種微生物是第十頁，共三十五頁。整理ppt1.稀釋涂布平板法〔活菌計數(shù)法〕⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。⑵計算方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：第十一頁，共三十五頁。整理ppt兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1.第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。2.第二位同學(xué)在該濃度下涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為結(jié)果。你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值?你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？分析：答：都不接近，都需要改進(jìn)。第一位同學(xué)需要設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)組。第二位同學(xué)統(tǒng)計的三個菌落數(shù)相差太大，說明操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。第十二頁，共三十五頁。整理ppt小結(jié)①為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度的稀釋液涂布到三個或三個以上的平板中培養(yǎng)。②為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計數(shù)，計算出菌落平均數(shù)③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。第十三頁，共三十五頁。整理ppt2、顯微鏡直接計數(shù)法：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)第十四頁，共三十五頁。整理ppt設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：第十五頁，共三十五頁。整理ppt實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時，A同學(xué)從對應(yīng)的106

倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤

(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))如何設(shè)計實(shí)驗(yàn)證明呢？第十六頁，共三十五頁。整理ppt小結(jié)：通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，那么證明A無誤；如果結(jié)果不同，那么證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第十七頁，共三十五頁。整理ppt二.實(shí)驗(yàn)的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第十八頁，共三十五頁。整理ppt◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行[三]樣品的稀釋第十九頁，共三十五頁。整理ppt◆別離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)目的細(xì)菌104、105、106放線菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計數(shù)的平板第二十頁，共三十五頁。整理ppt為什么別離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？分析：土壤中各類微生物的數(shù)量〔單位：株/kg〕是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。1：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行別離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第二十一頁，共三十五頁。整理ppt㈣.取樣涂布◆實(shí)驗(yàn)時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅?個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，那么說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，說明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第二十二頁，共三十五頁。整理ppt㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間缺乏而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第二十三頁，共三十五頁。整理ppt◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，那么說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，說明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第二十四頁，共三十五頁。整理ppt微生物的培養(yǎng)與觀察第二十五頁，共三十五頁。整理ppt三.結(jié)果分析與評價P251.通過對照實(shí)驗(yàn)，假設(shè)培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；假設(shè)培養(yǎng)物混入其他氮源，那么菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.稀釋操作是否成功：如果得到了2個或2個以上的菌落數(shù)在30—300的平板，那么說明稀釋操作成功。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)組的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確，要重新實(shí)驗(yàn)。第二十六頁，共三十五頁。整理ppt四、操作提示

無菌操作做好標(biāo)記

規(guī)劃時間

第二十七頁，共三十五頁。整理ppt五.課外延伸2、鑒定大腸桿菌的方法：在培養(yǎng)基中添加培養(yǎng)該細(xì)菌，如果出現(xiàn)菌落呈現(xiàn)，那么說明有大腸桿菌。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中參加指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。酚紅紅1、鑒定分解尿素的細(xì)菌的方法伊紅-美藍(lán)黑色且有金屬光澤第二十八頁，共三十五頁。整理ppt本課題知識小結(jié):第二十九頁，共三十五頁。整理ppt1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是〔〕A.培養(yǎng)細(xì)菌B.培養(yǎng)真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練CD第三十頁，共三十五頁。整理ppt3.以下說法不正確的選項(xiàng)是〔〕A.科學(xué)家從70－80度熱泉中別離到耐高溫的TaqDNA聚合酶B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值C.設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。4.為培養(yǎng)和別離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中參加〔〕A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC第三十一頁，共三十五頁。整理ppt5、以下表達(dá)錯誤的選項(xiàng)是[]A．因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量不同，所以為獲得不同類型的微生物，要按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行別離

B．測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍不同

C．只有得到了3個或3個以上菌落數(shù)目在30—300的平板，才說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)

D．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些細(xì)菌菌落C

第三十二頁，共三十五頁。整理ppt根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;本錢低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。合成培養(yǎng)基:第三十三頁，共三十五頁。整理ppt天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液〔如雞胚和牛胚浸液〕。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的