液相色譜和毛細(xì)管電泳第一頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

液相色譜法最初是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法

高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜理論而發(fā)展起來(lái)的分離分析方法與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)

又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLC)，也稱現(xiàn)代液相色譜15-1-1高效液相色譜法第二頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快：通常分析一個(gè)樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成分辨率高：可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果靈敏度高：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg柱子可反復(fù)使用：用一根色譜柱可分離不同的化合物樣品量少，容易回收：樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備第三頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三液相色譜的發(fā)展過(guò)程第四頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

液相色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。15-1-2液相色譜分離原理第五頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三樣品形態(tài)：液體氣體或液體(加熱氣化)流動(dòng)相:液體(黏度大，102倍)氣體(黏度小)輸送壓力：5-50MPa0.1-0.5MPa固定相：粒度5-10μm粒度0.1-0.5mm柱長(zhǎng):10-25cm1-4m(填)10-100m(開(kāi))檢測(cè)器：紫外TCD示差折光FID

熒光ECD電化學(xué)FPD應(yīng)用范圍：高沸點(diǎn)低沸點(diǎn)熱不穩(wěn)定（活性）永久性氣體強(qiáng)極性、大分子裂解產(chǎn)物15-1-3液相色譜與氣相色譜的比較第六頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)15-2高效液相色譜儀第七頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三液相色譜的基本流程圖流動(dòng)相

泵色譜柱檢測(cè)器

輸液系統(tǒng)分離系統(tǒng)

檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)AEGBCDF進(jìn)樣閥進(jìn)樣系統(tǒng)第八頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三由貯液器、高壓輸液泵、過(guò)濾器、梯度洗脫裝置等構(gòu)成15-2-1高壓輸液系統(tǒng)(2)高壓輸液泵：主要部件之一，壓力：5～50MPaa.為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），要使液體的流動(dòng)相通過(guò)，將施加很大的驅(qū)動(dòng)力b.應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性(1)貯液器：提供流動(dòng)相，脫氣，耐壓，溶劑裝入前要過(guò)濾第九頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三色譜輸液系統(tǒng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)混合腔真空脫氣泵

(

在線脫氣)壓力傳感器蠕動(dòng)泵清洗瓶一般為50％甲醇，每周更換一次清洗閥比例閥進(jìn)口單向閥出口單向閥泵第十頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三往復(fù)柱塞泵結(jié)構(gòu)示意圖往復(fù)柱塞泵結(jié)構(gòu)示意圖往復(fù)柱塞泵結(jié)構(gòu)示意圖往復(fù)柱塞泵結(jié)構(gòu)示意圖第十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三(3)梯度淋洗裝置外梯度:將不同極性的溶劑在常溫常壓下按一定的比例送入梯度混合室，利用一臺(tái)高壓輸液泵，泵壓進(jìn)入色譜柱內(nèi)梯度:將兩種或多種不同極性的溶劑分別增壓后，按設(shè)定的程序，注入混合室混合，再進(jìn)入色譜柱A:綠原酸B:蘆丁第十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三工作泵頭平衡泵頭壓力傳感器混合腔清洗閥真空脫氣泵比例閥廢液P680ALPG流路圖低壓四元梯度泵（只有一個(gè)泵，四個(gè)通道，溶液泵前混合）需配在線脫氣機(jī)，因?yàn)槿菀仔纬蓺馀莸谑?yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-2-2進(jìn)樣系統(tǒng)-手動(dòng)及自動(dòng)進(jìn)樣

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：Load狀態(tài)Inject狀態(tài)第十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三樣品盤機(jī)械手自動(dòng)進(jìn)樣第十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-2-3分離系統(tǒng)-高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm目前已采用小粒度的填料和柱徑以提高柱效第十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)特點(diǎn)：Ⅰ.靈敏度高、線性范圍廣；Ⅱ.對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；Ⅲ.波長(zhǎng)可選，易于操作；Ⅳ.可用于梯度洗脫

1.紫外檢測(cè)器15-2-4檢測(cè)系統(tǒng)第十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，檢測(cè)各特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示第十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值,差值與濃度呈正比

通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）3.示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器光路圖第十九頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三安培檢測(cè)器4.電化學(xué)檢測(cè)器柱后流出物進(jìn)入反應(yīng)池，在工作電極表面發(fā)生氧化、還原反應(yīng)，電極間有電流產(chǎn)生，電流大小與流出物濃度成比例，主要用于檢測(cè)具有電化學(xué)活性的物質(zhì)其它電化學(xué)檢測(cè)器：電導(dǎo)、伏安檢測(cè)器第二十頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-3液相色譜的分類

液固色譜液液色譜離子交換色譜排阻色譜化學(xué)鍵合相色譜反相色譜：非極性鍵合固定相，ODS正相色譜：極性鍵合固定相，CN基或NH2基鍵合相第二十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-3-1液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與脫附適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的脂溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾第二十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-3-2液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，現(xiàn)較少采用

流動(dòng)相：極性或非極性溶劑均可第二十三頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三分配色譜法使用的固定液正相分配色譜法的固定液反相分配色譜的固定液β，β-氧二丙烷1,2,3-三(2-氯乙氧基)丙烷聚乙二醇400,600甘油,丙二醇冰乙酸乙二醇乙二酸二甲基亞砜硝基甲烷二甲基甲酰胺甲基硅酮氰丙基硅酮聚烯烴正庚烷第二十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

15-3-3離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可解離的化合物，氨基酸、核酸等第二十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-3-4排阻色譜色譜

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離

第二十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-3-5化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上，如C-18柱（反相柱）

流動(dòng)相的極性小于固定液的極性，稱為正相色譜（normalphase）流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，稱為反相色譜（reversephase）根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)度，分為正相與反相色譜第二十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N第二十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性（5）有利于梯度洗脫第二十九頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三R：-C4,-C8,-C18-C6H5,-CN,-NH2-SO3H,-COOH,-NR4＋Cl----------化學(xué)鍵合固定相上鍵合的基團(tuán)R有:第三十頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三HPLC的應(yīng)用

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析第三十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：7.0105Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器第三十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三芴、苊、菲三混合美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)局16組分PAH混合物標(biāo)樣已知峰9為苯并[a]蒽和屈，峰14為苯并芘和二苯并蒽的二組分重疊峰第三十三頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三氨基酸分析

第三十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三HPLC含量測(cè)定應(yīng)用實(shí)例

ABCA.綠原酸對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.綠原酸測(cè)定方法:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10uL，按上述色譜條件測(cè)定，記錄綠原酸的峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算綠原酸的含量。結(jié)果：綠原酸峰面積供試品為：30.1562，對(duì)照品為：28.6288第三十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三HPLC與UPLC（Ultraperformanceliquidchromatography)固定相粒徑改變引起的范氏曲線的改變第三十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三whichshowsaseparationofeightdiureticsinunder1.6minutes.Thesameseparationona2.1by100mm5μmC18HPLCcolumnyieldsalmostidenticalresolution,buttakestenminutes.第三十九頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三Figure5showsapeptidemapwherethedesiredgoalistomaximisethenumberofpeaks.Inthisapplication,theincreasedpeakcapacity(numberofpeaksresolvedperunittime)ofUPLCdramaticallyimprovesthequalityofthedata,resultinginamoredefinitivemap.第四十頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-9高效毛細(xì)管電泳（CE)高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一、采用了50-75μm內(nèi)徑的毛細(xì)管二、采用了高達(dá)數(shù)萬(wàn)伏的電壓毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。電泳：帶電粒子或離子在電場(chǎng)的作用下作定向移動(dòng)毛細(xì)管電泳：電泳在充滿緩沖溶液的細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管中進(jìn)行第四十一頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

15-9-1基本原理1.儀器流程與主要部件電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器可檢測(cè)到：10-19～10-21

mol·L-12.毛細(xì)管柱（1）材料：石英，涂敷聚酰亞胺，具柔性（2）規(guī)格：內(nèi)徑50～75μm，外徑350～400μm；長(zhǎng)度≤1m第四十二頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三3.分離過(guò)程

電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)電泳現(xiàn)象和電滲現(xiàn)象

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和陽(yáng)離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出中性粒子無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反。ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出電滲：由于外加電場(chǎng)對(duì)管壁溶液雙電層的作用而產(chǎn)生的溶液的整體流動(dòng)。第四十三頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三4.高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)⑴儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化

電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、緩沖溶液瓶（電極瓶）⑵分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無(wú)機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽(yáng)離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)⑶操作方便、運(yùn)耗費(fèi)低

進(jìn)樣量極少，在水介質(zhì)中進(jìn)行⑷應(yīng)用范圍極廣

有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、生物、中性分子、生物大分子等分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等第四十四頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三15-9-2分離模式

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和陽(yáng)離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出中性粒子：無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出

陰離子：最后流出同種類離子由于荷質(zhì)比的不同而被分離最基本、應(yīng)用最廣的分離模式1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE第四十五頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三（1）緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束2.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC、MEKC）

在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)第四十六頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

（2）電泳和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)（3）中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間晚（4）可用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍第四十七頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三

在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以電滲流為流動(dòng)相，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動(dòng)色譜過(guò)程目前電色譜采用填充柱、開(kāi)管柱、整體柱等3.毛細(xì)管電色譜CEC第四十八頁(yè)，共五十七頁(yè)，編輯于2023年，星期三一、離子分析1.陽(yáng)離子分析離子遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內(nèi)分離了24多種金屬離子陽(yáng)極進(jìn)樣，陰極檢