福建農(nóng)林大學生物工程研究法課程實驗方案資料內(nèi)容僅供參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系本人改正或者刪除。福建農(nóng)林大學生物工程研究法課程實驗方案發(fā)酵工程研究法學院:生命科學學院學院:生命科學學院專業(yè)年級:07微生物一班組長:李彩斌指導老師:孫淑靜小組成員:馬起鋁,李國凡藍金蓮葉碧霞鄭梅欽李彩斌發(fā)酵工程課程實驗方案一、實驗目的1、掌握發(fā)酵微生物菌種篩選原理和方法2、學習和掌握酒精發(fā)酵方法和發(fā)酵過程的監(jiān)測方法3、掌握酒精對糖和淀粉的轉(zhuǎn)化率的計算方法二、實驗原理培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。培養(yǎng)基中一般含有微生物所必須的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應及時徹底滅菌。發(fā)酵成熟醪的成分隨原料的種類、加工方法、菌種性能不同而不同,分成不揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分兩大類。許多微生物都能利用已糖化進行酒精發(fā)酵,但在實際生產(chǎn)中用于酒精發(fā)酵的幾乎全是酒精酵母,俗稱酵母。利用淀粉質(zhì)原料的酒母在分類上叫啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),是屬于子囊菌亞門酵母屬的一種單細胞微生物。該種酵母菌繁殖速度快,發(fā)酵能力即產(chǎn)酒精能力強,并具有較強的耐酒精能力。淀粉質(zhì)原料酒精生產(chǎn)的工藝流程如圖所示:三、實驗材料、試劑和器材1、原料:玉米粉、已知酶活力糖化酶2、試劑:氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、DNS、碘液、pH4.6的醋酸鹽緩沖液3、器材:三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、血球計數(shù)器四、實驗步驟(一)酵母菌種的分離與篩選1、稱量50g的從超市中買來的葡萄放置搗爛,溶于上述的90ml的無菌水中,振蕩30min,制成原液。2、在超凈臺上,取1ml原液于9ml裝有無菌水的試管中,搖勻,制成10-1菌液,按照同樣的方法做成6個稀釋梯度,難后選擇4個合適的梯度進行涂平板,培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基,封口,每個梯度涂布三個重復。3、將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4d。4、觀察菌落的生長情況,選取菌落生長均勻的濃度梯度,進行劃線分離純化。5、在37℃培養(yǎng)箱中在培養(yǎng)3d。6、選取分離純化好的單菌落用顯微鏡進行觀察。酵母菌落形態(tài)一般大而突起,邊緣可見球狀、卵圓狀或假絲狀細胞。7、挑取鑒定出來的菌落與PDA液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。(二)酵母產(chǎn)酒精1、糊化:將600ml水加到糖化鍋中,按照料水比1:4的比例稱量玉米粉150g,調(diào)節(jié)pH值為5-6,加入氯化鈣(對固形物0.2％),加入液化酶(12-20U/g淀粉),在劇烈攪拌下,先加熱至72℃,保溫15min,再加熱至90℃,并維持30min,以達到所需的液化程度(DE值:15-18％),碘反應呈棕紅色。液化結(jié)束后,再升溫至120℃,保持5-8min,滅酶,壓濾去渣,降溫就能夠進行糖化了。2、糖化:液化結(jié)束后,迅速將料液用硫酸將pH調(diào)至4.3-4.5,同時迅速降溫至60℃。按照0.6-0.8%/g淀粉的比例加入糖化酶,攪拌均勻,放入水浴鍋中,60℃保溫若干小時后(10h左右),當用無水酒精檢驗無糊精存在時。用碘液測定糖化液是否還含有淀粉,若未完全則繼續(xù)糖化直至完全為止。注意開始時液面位置并隨時補足蒸發(fā)掉的水分。糖化結(jié)束后,將料液pH調(diào)至4.8-5.0,同時,將料液加熱至加熱90℃,保溫30分鐘．然后將料液溫度降至60-70℃,開始過濾。3、發(fā)酵前還原糖測定:取一些糖化好的糖化液,測定其還原糖的含量(用DNS法測定)。3.1葡萄糖標準曲線制作取6支試管,按下表1順序加入各種試劑。表1不同濃度葡萄糖的光密度試管編號123456蒸餾水32.52.01.51.00.5500ug/ml葡萄糖00.511.52.02.51各加入DNS試劑2.0mL;2沸水浴加熱5min;3立即用流水冷卻;3定容至25mL;550nm處測定OD值最后以葡萄糖含量(mg/mL)為橫坐標,光吸收值為縱坐標,繪制標準曲線。3.2糖化液還原糖測定(1)取5ml糖化液進行過濾,濾液用pH4.6的醋酸鹽緩沖液進行稀釋,約稀釋10-100倍。(2)取甲乙兩支10ml的試管,甲試管加入1ml稀釋的糖化液,乙試管加入1mlpH4.6的緩沖液,分別加入2mlpH4.6的醋酸鹽緩沖液和2mlDNS試劑。混勻后沸水浴加熱5min,立即冷卻定容到5ml。(3)混勻分別于550nm處比色,用乙試管調(diào)零,測3次,記錄光密度值。(4)然后在標準曲線上查得相應的還原糖含量Gmg。(5)根據(jù)以下公式計算樣品中還原糖的含量:還原糖含量(mg/ml)=Ga(a-稀釋倍數(shù),G-還原糖量(mg))4、發(fā)酵:將糖化好的糖化液分裝于三角瓶中,每瓶接種約15ml已培養(yǎng)24h的酵母菌,塞上膠塞(在加入的時候一定要注意防止雜菌的侵入,嚴格使用酒精火保護罐口,并保持罐內(nèi)正壓)。5、用干布將三角瓶各部分擦干凈,稱量初始發(fā)酵液的重量,將發(fā)酵液放于30℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵,并于以后每天稱量一次,直至重量減至恒重為止。并用DNS法測定發(fā)酵后的還原糖含量。(三)酒精發(fā)酵液各項指標測定1、酒精度測定:1)蒸餾:裝好全套蒸餾裝置,取100ml發(fā)酵能力較強的發(fā)酵液,放入500ml的蒸餾瓶中,加入100ml水,迅速安裝到冷凝管上進行蒸餾,將容量瓶置于冷凝管下端收集餾出液100ml時,停止蒸餾,搖勻備用。2)將酒精比重計慢慢放入酒精發(fā)酵液的蒸餾液中,手持溫度計在比重計桿旁,待溫度穩(wěn)定后,酒精停穩(wěn)定時讀數(shù),讀數(shù)時視線應與刻度計相平。3)校正:根據(jù)所量的酒精度和溫度、查表校正為20度時的酒精度。2、發(fā)酵液還原糖的測定:方法同發(fā)酵前還原糖測定方法一樣3、酒精發(fā)酵液的微生物檢查(1)酵母形態(tài)的觀察用美藍染色法取酒精發(fā)酵液菌體進行制片,在放大40倍及100倍的顯微鏡下觀察酵母形態(tài),用測微尺測量酵母細胞的大小,并進行死活鑒別。具體步驟如下:首先,在載玻片中央加一滴0.1%美藍染色液,液滴不可過多或過少,以免蓋上蓋玻片時,溢出或留有氣泡。然后按無菌操作法取在發(fā)酵液上培養(yǎng)了48小時的篩選出的酵母菌懸液一滴,放在美藍染色液中,使菌體與染色液均勻混合。取蓋玻片一塊,小心地蓋在液滴上,不能將蓋玻片平放下去,應先將蓋玻片的一邊與液滴接觸,然后將蓋玻片慢慢放下,這樣能夠避免產(chǎn)生氣泡。放置3Min。其次,將制好的水浸片先用低倍鏡觀察,半個小時后用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況,同時能夠根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死活細胞,因為活細胞的新陳代謝不停地進行著,因此細胞內(nèi)氧化還原值(rH)頗小,而還原力強,若有無毒的染料進入細胞,即被還原脫色,但死細胞及代謝緩慢的老細胞無此還原力。美藍無毒,且能為活細胞還原成無色,故可用以區(qū)別細胞的死活。但美藍濃度、作用時間等均有影響,應加注意。酵母細胞數(shù)的測定(酵母耐酒精能力的測定)1)取樣檢測獲細胞數(shù)目,用血球計數(shù)法:用適當稀釋的酵母菌液,加到蓋有蓋玻片的血球計數(shù)板上,根據(jù)所數(shù)計數(shù)格內(nèi)的細胞數(shù)、加入的菌液量和稀釋倍數(shù),計算出每毫升菌液的含菌量。2)耐酒精能力的測試:配成濃度為02%。。。。。等的水濃液加入等量的擴培過的酵母濃液,每隔2小時用血球計數(shù)板測酵母數(shù)目(改成血球計數(shù)板測數(shù)目)(3)不同酵母菌產(chǎn)酒精能力的測定本實驗主要采用稱重法與放出二氧化碳量等測定酵母的發(fā)酵能力:發(fā)酵瓶于30℃溫箱中進行培養(yǎng),每天稱重一次,記錄重量,由于每瓶用于發(fā)酵的糖化液體積相同,因此只需計算出單位時間內(nèi)CO2釋放量,直至發(fā)酵自然停止。以CO2產(chǎn)生量為縱坐標,發(fā)酵時間為橫坐標測定CO2產(chǎn)生曲線。(4)不同酵母凝聚性的測定:(采用本斯值法)將酵母菌在30℃搖床中搖瓶培養(yǎng)36h,離心棄掉上清夜,經(jīng)過無菌水洗滌3次后,稱重1g酵母菌于刻度15ml的離心管中,注入10mlpH值為4.5的醋酸鹽緩沖液,20℃水浴中放置20min,搖動離心管5min使酵母細胞重新均勻懸浮,靜置,記錄10min是酵母細胞的毫升數(shù),即為本斯值,根據(jù)本斯值判斷5個酵母菌株的凝聚性強弱。4、酒精生產(chǎn)中糖化型淀粉酶的酶活力測定(碘量法)1)待測酶液的制備取發(fā)酵液的濾液用pH4.6醋酸鈉緩沖液適當稀釋,供測定用。2)酶活力的測定于甲、乙兩支管中,分別加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/LpH4.6的乙酸緩沖液5ml,搖勻,在40℃的恒溫水浴中預熱5-10min,在甲管中加入待測酶液2ml(酶活總量約100-170單位),乙管中加2ml蒸餾水作對照,搖勻,立即記時。準確反應1h后,取出各加20%NaOH溶液0.2m1終止酶反應,冷卻至室溫。取上述反應液5m1放入碘量瓶中,準確加入0.1mol/L碘液10ml,再加入0.1mol/L氫氧化鈉15ml,搖勻后暗處放置15min。加入1mol/L硫酸2m1,用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至無色為終點。其與空白消耗硫代硫酸鈉毫升數(shù)的差值應在4~6之間,否則要適當調(diào)整酶液的稀釋倍數(shù)。計算糖化酶活力單位的定義:在40℃、pH4.6的條件下,1小時水解可溶性淀粉產(chǎn)生1毫克葡萄糖所需的酶量為一個糖化酶活力單位。酶活力單位=(A-B)N×90.05×(1/2)×(32.2/5)×n式中A——空白所消耗硫代硫酸鈉體積(ml);B——樣品所消耗硫代硫酸鈉體積(ml);N——硫代硫酸鈉濃度(0.1mol/L);90.05——1mllmol/L硫代硫酸鈉所相當?shù)钠咸烟琴|(zhì)(mg);1/2——折算成1m1酶液的量32.2——反應液總體積(ml)5——吸取反應液樣品的體積(ml);n——酶液稀釋倍數(shù)。5、出酒率、酒精對糖和淀粉的