淺論成骨誘導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與A【摘要】目的研究多孔磁性硅灰石/磷灰石玻璃陶瓷載體A-WMGC支架作為組織工程骨支架的可行性。方法體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在成骨誘導(dǎo)劑地塞米松等的誘導(dǎo)下，向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并使之與修飾后A-WMGC支架復(fù)合，通過倒置相差顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞貼附情況。結(jié)果地塞米松等誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)向類成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，堿性磷酸酶表達(dá)明顯增高，并表達(dá)Ⅰ型膠原。A-WMGC支架具有合適的微孔結(jié)構(gòu)，材料大孔孔徑為300～400μm,且孔道相互貫通，體外復(fù)合培養(yǎng)10小時(shí)，成骨細(xì)胞即開始貼附于支架上，復(fù)合培養(yǎng)7天，成骨細(xì)胞在支架上分化增殖，分泌細(xì)胞外基質(zhì)。結(jié)論適當(dāng)濃度成骨誘導(dǎo)劑可成功的將兔BMSCS成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，修飾后A-WMGC支架是骨組織工程的良好載體。

【關(guān)鍵詞】骨髓間充干質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)A-WMGC載體生物相容性

Abstract:ObjectiveToinvestigatethefeasibilityofapatite-wollastonitemagneticglassceramic(A-WMGC)asscaffoldmaterialinbonetissueThepurifiedbonemarrowstromalcellswhichwereseparatedfromrabbitwereinducedintoosteoblastsbyDexamethasone,β-glycerophophateandVitaminCandco-culturedwithmodifiedA-WMGCinvitro.Thecell-meterialcomplexwasobservedunderphasemicroscopeandelectronicscanningmicroscopeinordertoevaluatetheinteractionbetweencellsandA-WMGC.ResultsTheformoftheinducedcellsbyDexamethasonewasconvertedtolike-osteoblasts,theexpressionofALPincreasedobviously，andtheexpressionofCollagenIwasobserved.A-WMGCPossessedgoodmacroporousstructure:thesizeofmacroporeswas300～400μmindiameter,andporesinterconnectedeachother.Tenhoursafterco-culture,theosteoblastsadheredtoA-WMGCscaffolds.Sevendayslater,theosteoblastsdifferentiatedandproliferatedinA-WMGCnetwork.Extracellularmatrixwassecretedamongosteoblasts.ConclusionsRabbitbonemarrowstromalcellscanbeinducedintomarrowstromalosteoblastsbysuitablecontentsofdexamethasone.ModifiedA-WMGCisagoodscaffoldmaterialforthebonetissueengineering.

Keywords:bonemarrowstromalcells;osteoblastsinduction;apatite-wollastonitemagneticglassceramic;biocompatibility

骨缺損修復(fù)一直是骨科臨床的棘手問題，目前常用的修復(fù)方法均存在一定的缺點(diǎn)，難以滿足臨床需要。組織工程骨再造被認(rèn)為是最有前景的骨缺損治療修復(fù)方法。在一定誘導(dǎo)條件下，可使BMSCs向成骨細(xì)胞分化的數(shù)目大大增加［1,2］，表明其具有很強(qiáng)的成骨潛能，是應(yīng)用最為廣泛的種子細(xì)胞。細(xì)胞與支架材料的相互作用是組織工程研究的主要領(lǐng)域,細(xì)胞與材料的粘附是基礎(chǔ),細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)恼掣讲拍苓M(jìn)行遷移、分化和增殖。

單一的材料難以滿足骨組織工程細(xì)胞外支架材料的要求，只有通過合適的方法將幾種材料組合，在性能上互相取長補(bǔ)短，形成復(fù)合支架材料［3］。AW生物活性玻璃陶瓷作為一種硬組織修復(fù)材料，具有理想的生物活性和骨重建功能［4,5］。AW生物活性玻璃陶瓷植入體內(nèi)后，表面溶解，釋放出硅離子，能為羥基碳酸磷灰石形成提供合適成核位置，體液中的和溶解產(chǎn)生的鈣離子、磷離子則沉積生成富鈣、磷無定形層，并最終轉(zhuǎn)化為能與組織緊密結(jié)合的結(jié)晶羥基碳酸磷灰石層，其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)均與骨組織中的礦化相接近。

本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)兔BMSCS，在成骨誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下，向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并將其作為種子細(xì)胞，A-WMGC為支架材料，觀察細(xì)胞在材料上的生長情況，探索A-WMGC作為組織工程骨支架的可行性。

1實(shí)驗(yàn)材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板,胎牛血清,胰蛋白酶，TritonX-100,地塞米松，維生素C,β-甘油磷酸鈉，堿性磷酸酶試劑盒，多聚賴氨酸，A-WMGC載體，I型膠原原位雜交試劑盒。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物月齡健康新西蘭大耳白兔1只(由錦州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量許可證號：SYXK2003-0011)，體重2kg。

實(shí)驗(yàn)儀器倒置相差顯微鏡,AT-858自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，掃描電子顯微鏡。

實(shí)驗(yàn)方法

兔BMSCs的分離和培養(yǎng)：選月齡新西蘭白兔，無菌狀態(tài)下于兔股骨近端抽取骨髓2mL，采用貼壁篩選法，接種于培養(yǎng)瓶中，72小時(shí)后更換培養(yǎng)液，每日在倒置相差顯微鏡下觀察，3天換液1次。原代培養(yǎng)的BMSCS接近90%時(shí)，以%胰蛋白酶消化，離心，棄上清，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1×105/瓶接種，每日在倒置相差顯微鏡下觀察。

兔BMSCs的成骨誘導(dǎo)及鑒定：細(xì)胞傳至第3代后，進(jìn)行成骨誘導(dǎo),實(shí)驗(yàn)分誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)液為10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50mg/L維生素C,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，分別在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間測定堿性磷酸酶含量、Ⅰ型膠原的表達(dá)情況、Vonkossa染色。

堿性磷酸酶含量測量％胰蛋白酶消化細(xì)胞后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2000個(gè)/孔的密度接種于5塊96孔培養(yǎng)板上。實(shí)驗(yàn)分2組：誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組；每組10孔，每3天換液，于第4、6、8、10、12天分別取出1塊培養(yǎng)板，經(jīng)%TritonX-100處理后，4℃冰箱過夜，用酶標(biāo)分析儀測堿性磷酸酶含量。

Ⅰ型膠原的表達(dá)檢測％胰蛋白酶消化細(xì)胞后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)板內(nèi)置預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸防脫片處理的蓋玻片，每3天換液。實(shí)驗(yàn)分組同前，于第15天應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測各組Ⅰ型膠原的表達(dá)情況。

鈣結(jié)節(jié)Vonkossa染色誘導(dǎo)15天后取出細(xì)胞爬片，PBS清洗3次，2%AgNO3水溶液浸染，紫外線下處理30分鐘，蒸餾水洗1分鐘，5%硫代硫酸鈉水溶液處理2分鐘后自來水洗5分鐘。

A-WMGC支架材料的生物學(xué)特性:本實(shí)驗(yàn)所用A-WMGC支架材料由由四川大學(xué)周大利教授提供。該材料采用溶膠－凝膠工藝［4,5］制備，并通過造孔、成型及熱處理等步驟。A-WMGC支架材料為白色塊狀多孔物質(zhì)，孔隙率40%～50％，孔徑300～400μm，孔道相互貫通。

A-WMGC支架材料修飾及體外實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將A-WMGC載體環(huán)氧乙烷消毒，掃描電鏡觀察。將載體分別置于24孔培養(yǎng)板中。先后應(yīng)用無水酒精處理48小時(shí)，三蒸水處理36小時(shí),12小時(shí)換水1次。使材料充分濕化。每孔分別加入多聚賴氨酸將材料充分浸泡2小時(shí)，吸除多余液體，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)干燥，將傳了3代的成骨誘導(dǎo)的BMSCs制成濃度為4×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液,接種到裝有載體的24孔培養(yǎng)板中,移入CO2細(xì)胞箱培養(yǎng)4小時(shí)后,在支架周圍小心加入培養(yǎng)液,進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第3天和第10天取出24孔板內(nèi)的載體，PBS洗3次后，%戊二醛固定，10%～100%的乙醇梯度脫水，掃描電鏡觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用版本統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較均采用重復(fù)測量的方差分析。

2結(jié)果

原代和傳代培養(yǎng)時(shí)BMSCs的生長情況原代BMSCs于24～36小時(shí)開始貼壁,細(xì)胞為圓形，48～72小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)為較一致的長梭形、紡錘形,核較小,呈橢圓形,核漿比例小，4～5天細(xì)胞集落形成,逐漸增大,集落之間相互靠近。10～14天時(shí)集落邊緣融合,細(xì)胞呈較均一的旋渦狀或螺旋狀分布。傳代BMSCs在形態(tài)上與原代無明顯差別。

兔BMSCs成骨誘導(dǎo)后形態(tài)觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞自第3天可見部分細(xì)胞由長梭形逐漸變成長方形，并逐漸變?yōu)槎嘟切?，體積較誘導(dǎo)前增大，多角形細(xì)胞比例隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增高,見圖1。

兔BMSCs的成骨誘導(dǎo)鑒定

各組堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果：非誘導(dǎo)組堿性磷酸酶有基礎(chǔ)表達(dá)，但表達(dá)量低，隨時(shí)間略有增加；地塞米松等誘導(dǎo)組第4天時(shí)堿性磷酸酶表達(dá)與非誘導(dǎo)組無明顯差別,隨后堿性磷酸酶表達(dá)開始隨時(shí)間的延長而逐漸升高，,具有顯著性差異。

表1成骨誘導(dǎo)組兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞與非誘導(dǎo)組在不同時(shí)間點(diǎn)的堿性磷酸酶比較

*成骨誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組比較，,具有顯著性差異

各組原位雜交技術(shù)檢測Ⅰ型膠原結(jié)果：成骨誘導(dǎo)組檢測Ⅰ型膠原結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)可見大量棕黃色顆粒，見圖2。非誘導(dǎo)組結(jié)果為陰性。

鈣結(jié)節(jié)Vonkossa染色結(jié)果：成骨誘導(dǎo)組Vonkossa染色可見鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色鈣結(jié)節(jié)，見圖3。非誘導(dǎo)組結(jié)果為陰性。

未復(fù)合細(xì)胞A-WMGC載體的結(jié)構(gòu)觀察：未復(fù)合細(xì)胞載體在掃描電鏡下觀察，放大倍數(shù)為500倍時(shí)，可見材料呈孔隙均勻分布的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，孔隙表面光滑，孔隙率為40％～50％，見圖4。

細(xì)胞與修飾后A-WMGC支架復(fù)合的形態(tài)觀察：復(fù)合兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞后，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在載體表面生長情況，放大倍數(shù)為500倍。可見橢圓形的、多角形及不規(guī)則形的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞貼附于復(fù)合材料孔隙之間，見圖5。

3討論

運(yùn)用組織工程的方法修復(fù)組織缺損是近年來研究的熱點(diǎn),其中種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究的重點(diǎn)之一。骨組織工程研究要求有大量的來源穩(wěn)定的種子細(xì)胞，自體或異體的成骨細(xì)胞往往取材困難，來源有限，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞具有多相分化潛能，且分化是非定向的，但己經(jīng)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞仍具有轉(zhuǎn)化成其它類型間充質(zhì)細(xì)胞的潛能［6,7］，因而，在一定誘導(dǎo)條件下，可使其向成骨細(xì)胞分化的數(shù)目增加，表明BMSCS具有很強(qiáng)的成骨潛能骨髓間充質(zhì)細(xì)胞。向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的條件已經(jīng)非常成熟,在培養(yǎng)基中加入地塞米松、β－甘油磷酸鈉、維生素C就可以使之向成骨細(xì)胞分化［8］。已有研究將BMSCs種植于可釋放地塞米松和維生素C的支架，并植入裸鼠體內(nèi)，在體內(nèi)形成礦化的骨組織［9］。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到地塞米松等誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)向類成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，自誘導(dǎo)第3天可見部分細(xì)胞由長梭形逐漸變成長方形，并逐漸變?yōu)槎嘟切?，?xì)胞飽滿，多角形細(xì)胞比例高，部分區(qū)域細(xì)胞呈現(xiàn)漩渦狀分布。第4天時(shí)堿性磷酸酶表達(dá)與非誘導(dǎo)組無明顯差別,隨后堿性磷酸酶表達(dá)開始隨時(shí)間的延長而逐漸升高,與非誘導(dǎo)組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原位雜交檢測Ⅰ型膠原結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)可見大量棕黃色顆粒。Vonkossa染色可見鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色，對照組為陰性反應(yīng)。

作為多孔型骨修復(fù)材料，孔徑、孔隙率及內(nèi)部連通性是骨長入方式和數(shù)量的決定因素。研究認(rèn)為［5］49：孔隙率超過30％以后，孔隙之間能夠相互貫通，孔隙率越高越利于新骨長入，但孔隙率越高，多孔材料的強(qiáng)度顯著降低。本實(shí)驗(yàn)采用的A-WMGC支架孔隙率在40%～50％，既使孔隙相貫通，又滿足了臨床應(yīng)用對力學(xué)性能的要求。此外，材料孔隙大小應(yīng)滿足骨單位和骨細(xì)胞生長所需空間。一般情況下，孔尺寸在200～400μm時(shí)最有利于新骨生長。A-WMGC支架中2～3μm的微觀孔隙與300～400μm的宏觀孔隙相結(jié)合，孔道聯(lián)結(jié)貫通，孔隙結(jié)構(gòu)適度，符合作為構(gòu)建組織工程骨細(xì)胞支架材料的基本要求。

成骨誘導(dǎo)細(xì)胞與修飾后A-WMGC支架復(fù)合可見材料呈孔隙均勻分布的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，孔隙表面光滑，孔隙率為40％～50％。橢圓形的、多角形及不規(guī)則形的BMSCs貼附于復(fù)合材料孔隙之間，細(xì)胞充分伸展，向四周伸出偽足，分泌的細(xì)胞外間充質(zhì)包繞于細(xì)胞周圍。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的A-WMGC生物活性玻璃陶瓷多孔支架材料是一種新型的生物復(fù)合載體，具有良好的生物活性、合適的力學(xué)性能和孔結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)中證實(shí)細(xì)胞在其上貼附生長良好，是優(yōu)良的骨組織工程支架材料。

以后，我們將在此研究的基礎(chǔ)上，把成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞與A-WMGC支架復(fù)合植入動(dòng)物骨缺損模型，觀察A-WMGC支架體內(nèi)降解性能及成骨情況，為生產(chǎn)可用于臨床的組織工程化活性骨奠定基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

［1］KadiyalaS，YoungRG，ThiedeMA，Bruderexpandedcaninemesenchymalstemcellspossessosteochondrogenicpotentialinvivoandinvitro［J］.CellTransplant,1997,6(2):125-134.

［2］KishimotoKN，WatanabeY，NakamuraH，etal.Ectopicboneformationbyelectroporaticofbonemorphogeneticprotein-4gene［J］.Bone,2002,312(4):340-347.

［3］KohaneDS,LangerR.Polymericbiomaterialsintissueengineering［J］.PediatrRes,2008,63(5):487-491.

［4］KimBS,BaezCE,AtalaA.Biomaterialsfortissueengineering［J］.WorldJUrol,2000,18(1):2-9.

［5］AbiramanS,VarmaHK,KumariTV,etal.Preliminaryinvitroandinvivocharacterizationsofasol-gelderivedbioactiveglassceramicsystem［J］.BullMaterSci,2002,25(5):419.