中國紅豆杉內(nèi)生真菌在20升發(fā)酵罐中產(chǎn)紫杉醇的代謝規(guī)律研究[摘要]對1株分離自中國紅豆杉的內(nèi)生真菌，在20升發(fā)酵罐中進(jìn)行液體發(fā)酵并測定各時期紫杉醇的含量變化。結(jié)果表明：該種內(nèi)生真菌大量合成紫杉醇是在對數(shù)生長末期及穩(wěn)定期，并在111時紫杉醇含量達(dá)到最高即可結(jié)束發(fā)酵。[關(guān)鍵詞]中國紅豆杉；內(nèi)生真菌；液體發(fā)酵；紫杉醇引言紅豆杉為紅豆杉科(Taxaceae)植物，屬于裸子植物亞門的古老樹種，是冰川活動時期的孑遺植物，為世界上公認(rèn)瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，在地球上已有250萬年的歷史。它的生態(tài)環(huán)境獨(dú)特，散生于常綠闊葉林或針闊葉混交林，分布雖廣，但數(shù)量稀少，種群密度小，自身繁殖力弱，生長速度慢[1]；目前，全球紅豆杉屬植物僅存11種，我國有4種1變種。即東北紅豆杉(Taxus.cuspidata.sieb.et.Zucc)、西藏紅豆杉(Taxus,wallichiana.Zucc)、云南紅豆杉(Taxus.Tunanensis.Chengef.L.K.Fu)、中國紅豆杉(Taxus.chinensis.Rehd)、南方紅豆杉(Taxus.chinensis.Var.Mairei)[2]。紅豆杉屬植物在民間早有應(yīng)用，如云南紅豆杉的種子，枝葉就被作為驅(qū)蟲、通經(jīng)、利尿的草藥應(yīng)用[3]。美國國家癌癥研究中心(NCL)在1958年開始的抗癌植物篩選工作中發(fā)現(xiàn)該屬植物的樹皮提取物有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，1963年，E.Wall和M.C.Wani首先從太平洋紅豆杉的樹皮和根部分離到抗癌活性較強(qiáng)的純化合物，隨后通過X光衍射確定了其結(jié)構(gòu)為一紫杉烷(Taxane)屬萜類化合物，即紫杉醇(Taxol)。1971年，M.C.Wani發(fā)表了紫杉烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。而具有紫杉烷獨(dú)特骨架的衍生物及其生物堿類約有100個左右，其中多種成分具抗癌瘤作用，以紫杉醇作用最強(qiáng)[4]。紫杉醇(paclitaxel,商品名taxol)，分子式為C47H51O14N，分子量為853192,為一白色結(jié)晶體，熔點(diǎn)為213-216℃；微溶于水，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。紫杉醇分子在1位、2位和7位各有一個暴露的羥基，除1位的羥基由于在紫杉醇的三維立體結(jié)構(gòu)中位置被屏蔽而呈現(xiàn)較不活潑的惰性外，其它位置的羥基都非?；顫?，2位易被酰化，7位易發(fā)生氧化和異構(gòu)化，10位上的乙?；菀资ザ纬扇ヒ阴Ｗ仙即?。紫杉醇13位上帶有一長的脂側(cè)鏈，在一定條件下能分解，脫除脂側(cè)鏈，形成baccatinIII，堿是紫杉醇脂側(cè)鏈降解反應(yīng)的催化劑[27]，也就是說，紫杉醇分子結(jié)構(gòu)很容易發(fā)生變化。Schiff等后來證實紫杉醇具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制，它作用于細(xì)胞微管（Microtuble），通過與微管蛋白N端第31位氨基酸和第217～231位氨基酸結(jié)合，誘導(dǎo)和穩(wěn)定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使維管束不能與微管組織中心相互連接，將細(xì)胞周期阻斷于G2/M期，導(dǎo)致有絲分裂異常或停止，阻止癌細(xì)胞增殖，它對黑色素瘤及婦女乳腺癌有較強(qiáng)的抑制作用,已作為新型抗癌藥用于臨床。1992年12月29日，美國食品和藥品管理局(FDA)正式批準(zhǔn)了紫杉醇作為婦女卵巢癌患者的抗癌藥[5]。后又經(jīng)多年的研究和臨床實驗,使紫杉醇的抗癌范圍逐漸在擴(kuò)大,目前進(jìn)行的乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、軟組織癌、白血病和胃腸道癌的臨床試驗已取得很好的效果，被認(rèn)為是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的最有效的抗癌藥物[6]。此外，臨床上還觀察到它對其他疾病有一定的應(yīng)用潛力，例如，它具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗瘧的作用，對中風(fēng)、早老性癡呆和先天性多囊腎病也有一定的療效。紫杉醇由于其獨(dú)特的抗癌機(jī)制，特別是對普通抗癌藥物無能為力的某些晚期腫瘤均有良好療效。但由于原料和生產(chǎn)技術(shù)的限制，全球紫杉醇的產(chǎn)量嚴(yán)重不足，因此價格昂貴，紫杉醇市場已面臨供求關(guān)系的嚴(yán)重失衡。目前紫杉醇主要是從紅豆杉樹皮中提取的，紅豆杉資源在世界上非常有限，紅豆杉科植物生長緩慢，且樹皮中紫杉醇含量又低（約萬分之二）[7]。加之紫杉醇溶解性差，平均產(chǎn)量約0.015%生產(chǎn)，即每提取lkg紫杉醇需要砍1000～2000棵紅豆杉的樹皮。據(jù)估測（1993年），紫杉醇正式運(yùn)用于臨床以后，全球每年約需200kg以上。按現(xiàn)在的提取率0.03%計算，每年要收集700噸紅豆杉樹皮來提取，即使將全部的天然資源采伐，也只能滿足短期需要。隨著該藥品應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，所需紅豆杉數(shù)量將十分可觀，這也給紅豆杉資源帶來嚴(yán)重威脅，直接從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇，必然嚴(yán)重威脅生態(tài)平衡，造成對森林和人類環(huán)境以及生物多樣性不可彌補(bǔ)的損失。并且隨著我國對野生紅豆杉資源保護(hù)措施的不斷加強(qiáng)以及對盜伐紅豆杉不法行為的嚴(yán)厲打擊，利用野生資源生產(chǎn)紫杉醇已無可能，資源已經(jīng)成為從紅豆杉植物中提取紫杉醇的“瓶頸”。在我國，紫杉醇的需求量又十分巨大，雖有5個種，但分布量都非常少，因此紅豆杉藥用和資源保護(hù)形成了尖銳矛盾，尋找紫杉醇未來新的生產(chǎn)途徑已成為擺在人類面前的一項重大研究課題[8]。近年來國內(nèi)外主要從3個領(lǐng)域進(jìn)行紫杉醇生產(chǎn)的研究，即①化學(xué)合成法②植物細(xì)胞培養(yǎng)法③微生物工程法[9]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究，培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞系已超過10個，其中大部分已證實產(chǎn)生紫杉醇，但是離體培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵問題難以突破，例如，培養(yǎng)物生物量小，紫杉醇產(chǎn)率較低，生產(chǎn)周期長，并且還需要保持細(xì)胞生長與生產(chǎn)特性的穩(wěn)定等等[9]。Christen首次利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇后研究吸引了眾多的實驗室跟進(jìn)。ESCAgenefc:公司在1992年NCI主持的第二次紫杉醇研討會上宣布他們用細(xì)胞培養(yǎng)法所得產(chǎn)物紫杉醇含量為樹皮的2一5倍。中國的甘煩遠(yuǎn)[11]等發(fā)現(xiàn)云南紅豆杉細(xì)胞在發(fā)酵罐中生長速率達(dá)到12g/L,紫杉醇含量為0.119%，約為成年樹樹皮中含量的12倍，為栽培植株的40倍。但是這項技術(shù)同樣存在一些問題，即培養(yǎng)細(xì)胞的褐化問題等，短期內(nèi)成功應(yīng)用的可能性較小。目前人們普遍認(rèn)為，微生物工程法生產(chǎn)紫杉醇是最具潛在能力、最具可能性的一種方法[10]。植物內(nèi)生真菌（endophyte）是指生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯的病癥狀的菌，包括那些生活史中某一階段營表面生的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌（Latentpathogens）和菌根菌。植物內(nèi)生真菌是一類應(yīng)用前景非常廣闊的資源微生物。植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)中葉，DeBary（1986）首次提出植物內(nèi)生菌一詞“endophyte”，在其后幾十年中，先后有幾十種牧草中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌，近年來的研究表明，幾乎所有植物中都有內(nèi)生菌的存在，且其種類極為豐富。內(nèi)生菌主要生長在植物的皮下的組織當(dāng)中，并且植物內(nèi)生菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化，一方面植物體為其提供生長必須的能量和營養(yǎng)，另一方面，植物內(nèi)生菌又可通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號傳導(dǎo)作用對植物體產(chǎn)生影響。植物內(nèi)生菌的生物學(xué)作用主要又固氮作用、進(jìn)植物生長作用和增強(qiáng)宿主植物抗逆境、抗病蟲害等。并且植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生多種全新的活性物質(zhì)，作為生物防治資源、外源基因的載體和新藥的來源，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有這巨大的應(yīng)用潛力。隨著人們對微生物資源的不斷開發(fā)，微生物研究領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，微生物研究方法的不斷創(chuàng)新和改進(jìn)，內(nèi)生菌的研究越來越受科研工作者的重視。利用內(nèi)生真菌液體發(fā)酵的方法具有以下六個優(yōu)點(diǎn)：①微生物作為工業(yè)生產(chǎn)的源泉，可在發(fā)酵罐中進(jìn)行，源源不盡的進(jìn)行生產(chǎn)；②微生物發(fā)酵的方法容易擴(kuò)大化，發(fā)酵成本相對較低，利于工業(yè)化生產(chǎn)；③微生物生長僅需要常規(guī)的培養(yǎng)技術(shù)，在收集紫杉醇前，可通過優(yōu)化發(fā)酵條件、改進(jìn)技術(shù)來提高產(chǎn)量；④微生物易于通過基因工程等方法篩選高產(chǎn)菌株，提高紫杉醇的產(chǎn)量；⑤內(nèi)生真菌生長迅速，易于培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基相對較為經(jīng)濟(jì)；⑥可望滿足市場的需求，降低紫杉醇的價格[11]。1991年，美國蒙拿大植物病理學(xué)系Strobel研究小組從藥用植物太平洋紅豆杉（Taxusbrevifolia）樹皮中分離到1株具有合成與宿主相同抗癌藥物—紫杉醇內(nèi)生真菌（Taxomycesandreanae）[12],內(nèi)生真菌的研究逐漸成為熱點(diǎn)。1993年GaryAStrobel[13]等從短葉紅豆杉分離篩選的內(nèi)生真菌，產(chǎn)率為24～50μg/L；1996年又從喜瑪拉雅山紅豆杉中分離出另一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，產(chǎn)率為60～70μg/L[14]；1995年，日本NipponsteelCooporation[15]分離出產(chǎn)紫杉醇真菌，產(chǎn)率為40μg/L；1996年，加拿大NovoPharma公司[16]分離出一株產(chǎn)紫杉醇真菌，其產(chǎn)率高達(dá)116mg/L，為目前最高水平。我國邱德有等從云南紅豆杉（TYunnanensis）中分離出1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，但產(chǎn)率非常低，每升產(chǎn)率只能以納克計量；周東坡[17]等分離出了3株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，產(chǎn)率也僅為51.06～125.7μg/L。陳建華[18]等從云南紅豆杉中分離出230余株內(nèi)生真菌，經(jīng)檢測有5株表現(xiàn)出產(chǎn)紫杉醇特性，其中2株產(chǎn)率較高，約為1mg/L,是我國目前研究的較高水平。由于這些菌株產(chǎn)紫杉醇量很少，目前尚未投入工業(yè)性發(fā)酵生產(chǎn)。一般來說，發(fā)酵產(chǎn)量的水平要達(dá)到1mg/L左右才有工業(yè)生產(chǎn)價值[19]。但可通過培養(yǎng)基優(yōu)化、菌株改良等方法提高產(chǎn)量實現(xiàn)紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)。內(nèi)生真菌是一類應(yīng)用前景廣闊的微生物資源，用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)紫杉醇，是解決藥源問題的有效途徑[20]。搏本文泊通過河對所1株羞分離路自陜埋西留灘壩險的中恨國紅嶼豆杉?xì)v內(nèi)生朽真菌巨在爹發(fā)酵封罐榨中進(jìn)丙行勁液體擺發(fā)酵段，脹旨在撲研究團(tuán)中國禾紅豆憶杉內(nèi)銳生真拌菌在皺20蹈升嬸發(fā)酵隸罐中勇產(chǎn)紫摸杉醇飲的厚規(guī)律家，昌為開處發(fā)利蒸用這兄一珍不貴的胖真菌纏資源荒提供灘參考品依據(jù)蠻。牧1堡豬材料遵和方惰法孟1習(xí).矩1千材料裙1.批1.堂1丸供灰試菌線株既一株釘分離挨自舅中國悟紅豆洗杉悔的蓋內(nèi)生距真菌泳，編饅號窯為獵K紹10投A角；煉由鴿陜西園省資滋源生抖物重項點(diǎn)實不驗室娃食用克藥用潔菌菌托種保窗藏中妨心提答供?；?.既1.抄2華主笨要儀播器設(shè)何備潑高效鵲液相傷色譜山儀（年惠普進(jìn)HP茅-1紗10遲0疲）卵、對電子塌天平糧（抬FA案16樂04凡型）畫、殼20品L幸光照需發(fā)酵鮮罐（滅BI廳OT擴(kuò)EC白H-佩30睛00飽上海烏保興屬生物轉(zhuǎn)設(shè)備蠢工程侮有限遍公司餃）凍、寫烘箱據(jù)（賺LR盲H-肉25笑0-漲GS考）、按人工冠氣候鍛箱（四廣東嬌省醫(yī)塔療器紫械廠鉗）沸、明旋轉(zhuǎn)寸蒸發(fā)施儀（參RE青-5開2A杏AA襲，輩上海遙嘉鵬裁科技贈有限碼公司鄙）逗、闖循環(huán)素水多讓用真弓空泵失（商SH況Z-腐95慮B柄，持鄭州召杜浦鈴儀器捏廠）米、察滅菌倚鍋拘、超雨凈工使作臺練等副。哀1.旬1.壽3綁培狂養(yǎng)基禮母種亭培養(yǎng)多基階（圖馬鈴加薯駝20張0.邀0g故,協(xié)葡萄搭糖除20晴.0臣g岡,求瓊脂瘦20銹.辛0張g幻,慚H元2尤O葛10飼00歌.0丹0m覽L遲,域KH競2節(jié)PO還3劇5g鄉(xiāng)、M濃gS血O決4腦·7兩H垮2控O尺3g柄、V圓B1憑1惑0m蟻g、瞧pH顯自然催）媽；雨液體歐培養(yǎng)宇基迅（鹿馬鈴剃薯啟20未0.恒0房g此,宇葡萄護(hù)糖伍40企.0榜g蝕,坑H油2梢O哈1閱00沿0.漂0扮m替L純,據(jù)KH激2逗PO鼠3赴2.雹0酬g芳、M油gS逗O活4隱·7埋H跳2皮O錯0.登5g艙、飲(N坑H4蔽)書2堤SO功4暖3蔑.0隨g正、起蛋白窯胨惹5.猜0科g半、傘酵母劉膏視0.役8g搭、面V拴B1厲10杠mg掠、惡pH用自然抵）。就1糕.零2姓方法鴿1.筑2.伶1賄液體做發(fā)酵續(xù)（1晃）菌得種活匹化瞎村在登試管尊斜面澤接入冷母種哪，于滲28秒℃疏下活屋化培跳養(yǎng)度5～拾7d室，待擦菌絲際布滿桿斜面侄，放到入瘦4迫℃漆冰箱日備用妹。擦（2層）液壓體種壤制備買嚇制備稼液體屯培養(yǎng)梢基，稀分裝駁于三扇角瓶顏中柄,砍裝液亦量程30撇0m清L納／奶50跳0m籮L菠，于貫12騾1.仁3飯℃究滅菌私30悄mi旗n狀，冷覺卻后育將已所活化觸的菌苦株接蕩入液濃體培敞養(yǎng)基腦中，冷靜置欣培養(yǎng)桃后轉(zhuǎn)覽至振裁蕩培爹養(yǎng)箱譽(yù)，在錄28眼℃汗，致16寶0r雪/m貧in捧的振云蕩培拌養(yǎng)，浸培養(yǎng)排4d謀，待宰長出贈大量字菌絲意球后匠，置蓋于只4牧℃曉冰箱哀保存句，備枕用。親（3次）液胃體發(fā)常酵分瓶設(shè)置販攪拌編軸轉(zhuǎn)縣速當(dāng)12稼0葉～冠21灣0r滲/m腸in鈔、壽空氣燃流量貫1.龍2L甲/m襪in喬、優(yōu)發(fā)酵鏟罐內(nèi)紋溫度頑28貿(mào)℃魯、取pH斃6.生0菊；武pH零電極簡、溶堵氧電岡極及送酸堿樣蠕動化泵校受準(zhǔn)；誠制備貴液體家培養(yǎng)叔基蝦14貿(mào)L宋，咐由加視料口臟加入軌發(fā)酵霧罐內(nèi)渡，同月時加羅入適受量的電菜籽肌油作橡消泡腹劑；拿啟動絡(luò)蒸汽封發(fā)生粒器對新發(fā)酵玩罐內(nèi)伯發(fā)酵駱液實隔罐滅般菌，秤待冷捐卻后熊放置模24犁h庭檢查突各參最數(shù)確咬定滅瘡菌是炎否徹繭底；騰將液中體種童由索接種翁口接權(quán)入揮，前至此家發(fā)酵成開始件。禍1.柜2.紐2司紫杉法醇笑萃廚取杠每粒3h著抽取妥發(fā)酵勝液待50掙0等mL陽；亞布什嚷漏斗測抽慮端過濾兆發(fā)酵隊液的，菌籍絲體走水洗誘兩遍或，收零集度置于妹烘箱牌（趣48按℃珠）烘繁至恒落重資；敞取菌攀液于姐65旱℃剩旋轉(zhuǎn)拔蒸發(fā)老至1旱/1唯0體桌積后趨，加節(jié)入等淋體積近的競乙酸父乙酯薯進(jìn)行俗萃取淋，收對集萃霉取劑灘相；育將菌爪絲體歷放入化研缽孔研磨禁至菌勉絲體搶完全主破碎批，鍵加入寨一定飾量離乙酸耽乙酯障超聲冤波提幅取3秒0橡mi幼n播3次乳，收慈集乙結(jié)酸乙貼酯相繼。合枯并襪發(fā)酵袍液和羽菌絲容體晉乙酸州乙酯槳相，巾并于因60思寺℃透旋轉(zhuǎn)設(shè)蒸發(fā)童至干冠，用則少量毅甲醇際溶解慘后定拍容至泉10脊ml行，置撕4董℃染冰箱丘保存日以備勻用沖。娘1.噴2.州3妨分予析檢扶測想利用持HP否LC鄭建立揮紫杉功醇標(biāo)分準(zhǔn)曲楚線瓦：添稱取餡紫杉色醇標(biāo)輔準(zhǔn)品庭0.呈85撤mg朗，用博乙醇燙溶解役，掘定溶亡至郊10去mL橋。高伯效液樣相色妄譜總(H沒PL殃C)倍祖測定玩，秒條件切為死：刷流動么相蠻，詠甲醇白：劇水筋(v害/減v)土=晃6桶5紅∶只35涉，管C1鉗8柱養(yǎng)(味4.是6貨mm魯×要15新0油mm瞞,眼5壘μm狐)疊，晨流速刑1m滴L/則mi滲n肅，橋檢測鄙波長拒22乖8n霧m.挑，進(jìn)注樣量停2罵0μ翅L響，單翻點(diǎn)繪木制標(biāo)么準(zhǔn)曲故線。飛將上敵述已薪用乙懷醇溶朵解的紹紫杉波醇提李取物陳經(jīng)濾片膜過教濾后漢上高貞效液斜相進(jìn)電行檢汽測。培紫杉業(yè)醇標(biāo)絹準(zhǔn)品漏的勸HP憲LC毅色譜括圖扇（耀圖韻2.妖1站）體，紫淘杉醇助物質(zhì)竿的欠出峰姐時間她在報11惰.0然01鳥mi差n竭。眾圖甩1.炕0悄紫杉襯醇標(biāo)礎(chǔ)準(zhǔn)品吃HP獸LC義色譜餅圖角Fi雷gu株re齒級1.界0回F蝴er普me羊nt筐at庭io匠n襪ex我tr斜ac愈ts季o積f嘴Ta暫x-宅2嬸HP吳LC囑結(jié)果律與分脖析柱產(chǎn)紫側(cè)杉醇垃動力邁學(xué)曲區(qū)線悼pH棗隨時涂間的臨變化刊關(guān)系榴在發(fā)腥酵過悔程中傍，腰K穩(wěn)10勝A柿菌代續(xù)謝產(chǎn)僻酸，膀須復(fù)配置彼堿液個用以覺維持威發(fā)酵定環(huán)境蘿在慮5.像8烘～6氏.2站的適約宜煤范圍櫻；綱圖葵2.宮1鉗倍P羊H隨弄時間錯變化盲關(guān)系擔(dān)由囑圖零2.思1池表明勺，前異24推小時鐘停俯留笛在延盲滯期剖，野pH匠下降剛不明咸顯；祥到第辦39含h時血，p歉H迅褲速下悉降，煩說明輩菌絲允體進(jìn)室入對老數(shù)期陶；義第4測8h委，由畝于菌艦絲體要代謝笛產(chǎn)酸浩，統(tǒng)pH洋低于矮5.迫8從,呀堿液嶼自動辯加入錄，p擁H盟迅速異在第喉57寬h恢書復(fù)到袖6.輪2。凳由此話可見桃，加厭入堿惕液可神以使旦pH允維持測在一碑個有感利于往菌絲末體生尤長代億謝以轟獲得伴紫杉披醇老最高端積累急量罪范圍低。臟2.低1.范2石樸溶氧粉隨時炸間變初化術(shù)關(guān)系糧圖趴2.透2擾溶氧記與發(fā)炒酵時弦間的蘋關(guān)系撤圖2滴.2迫表明朋，隨抹著發(fā)若酵的村進(jìn)行譯，發(fā)親酵液撥中的濾溶氧姥呈下憂降趨僅勢。鋪從接戴種到沙發(fā)酵待進(jìn)行淋到第慈24潛小時池，況溶氧爹基本附維持妹在7景0%胡左右斯，尋說明盒K爪10仔A困內(nèi)生筐真菌娛進(jìn)入賄一個率新環(huán)僵境處段于生橋長延殃滯期路并一船直延紋續(xù)到從第3令6h佩；從知第3雪6h對～谷60址h可怕見溶秋氧曲績線迅秩速下避降，共說明冷K裝10堡A斑內(nèi)生廢真菌鳳已經(jīng)技完全眠適應(yīng)念了新視的環(huán)危境并教迅速卷繁殖援進(jìn)入蝶對數(shù)紙期，研此時撞菌絲騰體濃犧度逐組漸達(dá)距到最徐大，狂大量恨菌絲原體需欺消耗亂大量菜的溶逢氧桿，使隔的發(fā)宏酵液此中的鹿溶故氧迅糧速減貌少；魯當(dāng)發(fā)筆酵進(jìn)蜻行到貴第6喘6小露時的疼時候堅，發(fā)躍酵液爪中溶覽氧僅它為3耳.4鞭%，要提高迎轉(zhuǎn)速坐及空已氣流這量溶銀氧提菠升效殼果被不明而顯占，觀污察發(fā)視酵液程，穩(wěn)菌絲司體密傅度非姑常大房，發(fā)逗酵液漏粘度虜阻力簽變大戚，致船使空福氣氣鞠泡不極能最答大限挺度的昏與發(fā)提酵液儲接觸煙傳遞悟氧氣折。從吧第6除9h鑼開始紐，K亮10斑A糊內(nèi)銳生真色菌進(jìn)叛入穩(wěn)謹(jǐn)定期徐，溶冒氧繼閥續(xù)小鐘幅度幕下降盟，撕其原涼因是式：(適1)庭高密撈度的華菌絲支體需撫要消蹈耗大槳量的嫩氧氣帳；（圈2）抵高密奏度菌育絲體皺增大阿了發(fā)泛酵液宏的流洗動阻晉力削使空欣氣不抓能充宏分與扒發(fā)酵夕液混拾合接喉觸舊；英(3井)發(fā)潔酵液醒中的乎次生值代謝稠產(chǎn)物搞如多企糖唉的產(chǎn)勻生增態(tài)加了持發(fā)酵污液的飼黏度堡，阻薄礙了高氧在酷發(fā)酵拉液中泰的傳論遞。被2.壺1.誓3舞顆紫杉客醇積傘累與者時間圍關(guān)系茫圖柱2.寄3探紫杉保醇與勒發(fā)酵墊時間教的關(guān)粒系懸由圖波2.猛3可援以看臺出，撕紫杉煌醇的播積累頂量與掉溶氧穩(wěn)消耗擔(dān)菌絲否體生愚長呈弱一定堪線性邊關(guān)系掉；結(jié)贏合溶漏氧圖割，延吊滯期續(xù)（0百～湯36割h）略以及莊對數(shù)薦生長癢前中響期（燈36壯～際57奪h解）矩都沒時有紫涂杉醇歪的章產(chǎn)生嶼積累章；岔但在聰對數(shù)握生長震期后融期接紫杉逢醇開押始大臥量合兔成，溉在穩(wěn)寨定期窗（6阻0坑～之90插h）沾合成漿速度匆達(dá)到丑最快飄；可暗以判瓜斷，許K粥10忠A凈內(nèi)駝生真專菌進(jìn)徑入穩(wěn)聯(lián)定期落后才辮會大巧量合果成紫羽杉醇特等次圣生代筐謝祝產(chǎn)物紫；貫但紫辦杉醇岔的合重成會激對自別身細(xì)微胞產(chǎn)難生某繡種程窗度的怨生理膊毒性欲，而杯抑制阿菌絲贊體的統(tǒng)生長禾[促21交]出；隨欺著細(xì)帶胞內(nèi)討紫杉貫醇濃脾度的盈升高尼，也萌會阻挪遏紫串杉醇因進(jìn)一支步合椒成泛（1齊02古～禍10竭8h勤）挨；發(fā)襖酵至遺11道1h鍵時，走紫杉等醇含射量不耍再增解加巴；因凱此可稻以確捆定，撿K銜10殲A枕內(nèi)聽生真榨菌司的發(fā)輕酵罐坊液體貴發(fā)酵陵在1廟11當(dāng)h恒時可蝶以結(jié)博束霧發(fā)酵臭。家3脊小結(jié)撫利用烏內(nèi)生答真菌復(fù)來合駝成景紫杉驗醇是逢近年裂來開匠展的概紫杉介醇資籍源研棍究的框方法炮之一校，尚已處研救究給初級康階段必。辣本實慎驗是具通過搭對中溉國紅昨豆杉胳內(nèi)生魔真菌伍進(jìn)行底實罐搜連續(xù)恥發(fā)酵快來確亦定發(fā)酬酵繼過程艦中嗎紫杉地醇含慢量的浩積累戶變化貞規(guī)律眠；最同終確職定該跡種內(nèi)禮生真吊菌大伏量合怖成紫創(chuàng)杉醇昏是在皇對數(shù)勞生長捧末期各及穩(wěn)巴定期趟，并賭在埋11挺1h軍時紫上杉醇畜積累吐達(dá)到哄頂峰主結(jié)束脊發(fā)酵毫。本多實司驗使減用地20缺L偽發(fā)酵檔罐進(jìn)總行實魯罐發(fā)椒酵，庫發(fā)酵羽環(huán)境赴比三到角瓶炒搖床寶培養(yǎng)船更接綢近于療工廠侵大規(guī)潑模發(fā)遺酵罐何實罐攤發(fā)酵未；你利用墳內(nèi)生鴿真菌芝來發(fā)薯酵生盼產(chǎn)紫遇杉醇綱是近栗年來勝解決箏紫杉樣醇資召源短皂缺的胖一問條校潛在鵲途徑馳。瓜綜上鉛所述繭統(tǒng)能為紀(jì)中國扁紅豆托杉內(nèi)勵生真園菌在所工業(yè)肆發(fā)酵仍放大界生產(chǎn)吸中三提供已理論刻依據(jù)程。頓參考杯文獻(xiàn)猾[1壟]發(fā)中國限科學(xué)園院微廣生物途研究蛙所《值菌種豪保藏恨手冊勾》編玻寫組已.域菌種份保藏蠅手冊慈[M鋸]丘.幕北京范:氣科學(xué)遇出版嚷社戒,1元98濁0腳,1荷14劍.久[2辟]管田成篇國捐,計吳鍵閑.浪紅豆套杉抗喜癌有券效成棄分的烤研究殲[嶼J膚].倉貴州等師范呀大學(xué)雖學(xué)報漏,1籃99咬9,弱17桿(4瞇):標(biāo)19思～2卷1.挽[3銀]嚇張炯柴炯攪.胃紅豆怪杉植振物資動源的良開發(fā)捏利用順[J升].階生物卸學(xué)雜萄志農(nóng),2妹00缺0,查8膽(4萄):捷30起～3僻1.孤[4垂]麗周東駕坡狠,飽平文故祥繩,嶄孫劍伏秋等娃.捏紫杉誓醇產(chǎn)配生菌標(biāo)分離稀的研舉究鼻[J覺].寺微生耕物學(xué)碧雜志默,2摩00恐1,淘3妥(2西1)刻:1孫8～液19材.峽[5索]繼王潤丈玲喝,怒陳涓此.箱紫杉熄醇的鈔研究尤及應(yīng)蠢用進(jìn)獵展容.音中藥右學(xué)倍,1淋99屈7,允28犬(怖增刊嶄):飯5～對7潛.魚[6淡]亦Ki毯ng肚st綠on攀D頁G劉I,摘Mo礦li哄ne勉ro退A受A魚,R鼻im擴(kuò)ol柴di出J會M輸.T劫he島t適ax木an凱e藥di互te月rp座en咽oi槽ds企[A似].享In棵:H芒er攻z近W,丈Ki較rb咳y鈴G豬W,吃Mo極or暗e絹R脊E,攪et庸al棍,e犧ds亦.P用ro主gr啄es艷s潔in傻t集he改c毛he傷mi棚st牲ry旨o(jì)盲f引or濟(jì)ga雖ni螞c句na排tu謊ra晃l咸pr慈ao輸du斜ct死s界[悅C]筍,N及ew飼Y奸or他k:調(diào)Sp醬ir姑in秩ge斧r藥Ve潤rl進(jìn)ag獅,1護(hù)99峰3,幫61橫:3階1～方60狼.妙[7設(shè)]聽方起寬程易,挨方唯騙碩鈴.距紫杉釀醇的肝研究灣進(jìn)展騰[J存].粱中草典藥融,1蕩99璃7,續(xù)28距(素增刊花):以1～換5顛.透[8異]籌王海壯燕粱,但李運(yùn)猾曼徹,箏劉國線卿頌.炸紫杉謙醇抗登癌機(jī)樸制研刻究進(jìn)舊展舞[J趟]杰.咱藥學(xué)統(tǒng)進(jìn)展野,1渠99紋9,左23熱(4劍):呼20安9.憑[9暗]泰王正售平箏.脈天然甚抗癌帶藥物剃—植紫杉顛醇裹[J賢]擇.姑應(yīng)用伏科技分,2溪00跪4,炕31鄭(1亭):伯56少～5剩8蔑.包[1它0]淡經(jīng)丁如瓶賢寺,沃王昊醬.截紅豆鈔杉的土生物臨工程咱研究熊進(jìn)展薄[J鴿]籍.驕藥學(xué)讀實踐境雜志首,2素00增0,狹18墓(5夸):企27抹4～描27令6.拴[1型1]殘裕林福綠呈承,拜劉小氏紅車,廈王洪問凱等催.睡紫杉甩醇及否其產(chǎn)睡生菌渾的研盒究現(xiàn)荒狀與慰展望母[J隊]炕.逼微生徑物學(xué)歌報即,2嘉00湊3,絨43盤(4努):塵53肺4～戰(zhàn)53代8.治[1駛2]錢S脊ti欲er座le撲A冒,腳S挪tr關(guān)ob盞ei拾G層,抗St鞏ie自rl敵e閣D.黑T載ax饅ol初a嶼nd總T辭ax撲an盞e仰Pr款od本uc核ti否on卵b斷y擋Ta筒xo從my帽ce譯s尺an朝d逼Re鍛an祥al家,擴(kuò)a銜n緒En孩do愧ph笑yt熟ic拖F濃un丟gu歇s肅of掉P煉ac端i擴(kuò)fi我c饒Ye侄w肆[J芬]栽.夫S澡ci通en才ce芹,缸19地93讓,叼26爺0起:技21治4士～菌21襯6.庫伍[