多功能酶標儀演示文稿本文檔共49頁；當前第1頁；編輯于星期三\3點23分主要內容一、ELISA法介紹二、酶標儀和多功能酶標儀三、儀器操作本文檔共49頁；當前第2頁；編輯于星期三\3點23分一、ELISA法介紹經典的化學分析方法（如滴定分析、重量分析、分光光度法）能對化學體系組分進行常量或微量分析，而對復雜生物體系的微量成分的測定往往力不從心。在此背景下，科學家研發(fā)了一系列測定生物體系成分含量的方法，其中免疫化學法（如酶聯免疫法、免疫熒光法、放射免疫法）因具有高特異性、超微量分析生物體有機成分的特點而得到迅速推廣和發(fā)展。本文檔共49頁；當前第3頁；編輯于星期三\3點23分1971年人們建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數分鐘后就可被識別出來，并進行定量，這種技術被稱為酶聯免疫吸附試驗法，簡稱ELISA。（Enzyme-LinkedImmuno-SorbentAssay）酶聯免疫法的專用儀器就是酶標儀。本文檔共49頁；當前第4頁；編輯于星期三\3點23分分析原理酶標儀的分析原理與分光光度法一樣，服從朗伯比爾定律。物質的含量與顯色液的顏色深淺成正比，而顏色深淺可用吸光度表示，所以物質的含量與吸光度值成正比。酶標記抗原或者抗體發(fā)生免疫學反應后，與底物的結合物，在特定波長下有最大吸收，可通過測定顯色液的吸光度對待測物進行定量。本文檔共49頁；當前第5頁；編輯于星期三\3點23分ELISA法知識1.免疫學知識2.常用的ELISA分析3.ELISA應用本文檔共49頁；當前第6頁；編輯于星期三\3點23分1.免疫學知識什么是抗體？什么是抗原？什么是抗原抗體反應？本文檔共49頁；當前第7頁；編輯于星期三\3點23分什么是抗體(Antibody)？抗體是機體受抗原刺激后，在體液中出現的一種能與相應抗原發(fā)生反應的球蛋白，稱免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)。人類免疫球蛋白有五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。含有免疫球蛋白的血清稱免疫血清。本文檔共49頁；當前第8頁；編輯于星期三\3點23分免疫球蛋白（Ig）免疫球蛋白（Ig）是機體受抗原刺激后產生的，其主要作用是與抗原起免疫反應，生成抗原-抗體復合物。可以阻斷病原體對機體的危害，也可以引起過敏反應或其他有害反應。本文檔共49頁；當前第9頁；編輯于星期三\3點23分

免疫球蛋白的結構免疫球蛋白都是大分子的物質，輕鏈和重鏈，且具有抗原結合的部位。本文檔共49頁；當前第10頁；編輯于星期三\3點23分

什么是抗原(Antigen)？

凡能刺激機體產生抗體，并能與抗體發(fā)生特異性結合的物質稱為抗原。物質所具有的這種特性稱為抗原性?？乖奈镔|可以是機體自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。也有外來的抗原（如病毒、污染物）。本文檔共49頁；當前第11頁；編輯于星期三\3點23分抗原的特異性

各種抗原物質的化學組成雖然很復雜，但能刺激機體產生抗體并與抗體反應相結合的化學組成，僅僅是抗原物質表面的一些具有活性的化學基團、化學結構及空間構型，被稱為抗原物質決定簇。分子結構的差異性，決定各種物質抗原的特異性。本文檔共49頁；當前第12頁；編輯于星期三\3點23分抗原抗體反應抗原與抗體的反應統(tǒng)稱為免疫學反應。在體內進行的抗原抗體反應稱為免疫反應，在體外進行的抗原抗體反應稱為血清學反應。沒有抗原的刺激，機體不能產生抗體；利用抗體可以檢測抗原物質。本文檔共49頁；當前第13頁；編輯于星期三\3點23分ELISA法特點ELISA法是建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎上，因而，具有特異性。由于測定中需要酶標記抗原或抗體，酶分子與抗原或抗體分子的結合物可以催化底物分子發(fā)生反應，產生放大作用，正因為此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。本文檔共49頁；當前第14頁；編輯于星期三\3點23分2.常用的ELISA分析1).測定抗原2).測定抗體本文檔共49頁；當前第15頁；編輯于星期三\3點23分(1)測定抗原

A

將抗體吸附于固相表面，這個過程叫包被。B

加抗原，形成抗原-抗體復合物。C

加酶標抗體。D加酶反應的底物。反應終止時，反應液的顏色深淺與抗原的含量成正比。本文檔共49頁；當前第16頁；編輯于星期三\3點23分主要步驟1.包被抗體的酶標板（一抗）。2.加待測抗原。抗原抗體反應，洗滌。3.加酶標抗體（二抗）。反應，洗滌。4.加顯色底物（三抗），反應，洗滌。5.加終止液。6.酶標儀上讀取吸光度值。7.根據標準曲線對待測抗原進行定量。本文檔共49頁；當前第17頁；編輯于星期三\3點23分(2)測定抗體A

抗原包被在酶標板。B

加抗體，形成抗原抗體復合物。C

加酶標抗體（一抗）D

加酶底物（二抗），顯色，比色。ABCD本文檔共49頁；當前第18頁；編輯于星期三\3點23分3.ELISA方法的應用原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。在實際應用中它和醫(yī)學、生物化學、免疫學、微生物學、藥理學、環(huán)境學等方面密切相關。本文檔共49頁；當前第19頁；編輯于星期三\3點23分舉例醫(yī)學方面：腫瘤研究中檢測甲胎蛋白；檢測過敏原；檢測血清中白蛋白及免疫球蛋白；傳染病診斷中檢查乙型肝炎表面抗原。環(huán)境科學方面：測定污染物抗原干預下生長因子、細胞因子、酶的變化。其他：植物組織漿液中檢查植物病毒；普通比色分析。本文檔共49頁；當前第20頁；編輯于星期三\3點23分二、酶標儀和多功能酶標儀普通酶標儀多功能酶標儀本文檔共49頁；當前第21頁；編輯于星期三\3點23分1.普通酶標儀即酶聯免疫檢測儀(ELISAReader）Bio-RadModel5504萬元本文檔共49頁；當前第22頁；編輯于星期三\3點23分光源光電檢測器電信號經前置放大、對數放大、模數轉換等濾光片或單色器酶標儀結構及原理本文檔共49頁；當前第23頁；編輯于星期三\3點23分光源：鎢燈濾光片：常用的波長范圍：405nm450nm(四甲基聯苯胺)490nm(鄰苯二胺)630nm單色器：可調節(jié)波長的光本文檔共49頁；當前第24頁；編輯于星期三\3點23分比色裝置：聚苯乙烯塑料微孔板：96孔光電檢測器本文檔共49頁；當前第25頁；編輯于星期三\3點23分酶標儀與光度計的區(qū)別波長：4-6個比色裝置：酶標板，非比色杯光路：垂直功能：不能波長掃描；只在固定波長的可見光范圍測定；可對化學物及生命組分進行終點分析。本文檔共49頁；當前第26頁；編輯于星期三\3點23分酶標儀的應用普通酶標儀基本功能有2個：（1）相當于分光光度計：測定化合物含量或者細胞存活率等。（2）基于免疫反應的ELISA分析。新型的多功能酶標儀價格在20-50萬元，分析功能得到廣泛拓展，這對酶標儀的應用有深刻的意義。本文檔共49頁；當前第27頁；編輯于星期三\3點23分ELISA的局限性世界衛(wèi)生組織專家組提出對ELISA的評價認為：“ELISA作為免疫診斷應用是一個好辦法，但要做好它不容易?！?.對ELISA法的非特異性評價的資料尚不夠完善，因此，對出現一些非特異性反應的時候，往往不易解釋。2.固相載體的質量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還不一致，致使不同批號的固相載體有時本底值較高，有時吸附性能很差，影響試驗結果。3.試劑不統(tǒng)一，現在處于“八仙過海，各顯神通”，標準還不能統(tǒng)一。本文檔共49頁；當前第28頁；編輯于星期三\3點23分2.多功能酶標儀Thermo公司全波長多功能酶標儀50多萬元本文檔共49頁；當前第29頁；編輯于星期三\3點23分多功能酶標儀的特點1.比色杯或者微孔板（6、12、24、48、96和384孔微孔板）,測樣量大；2.200-1000nm，有紫外可見光、熒光、偏振光等,波長變化可達到1nm,只要是有色溶液即可測定吸光度；3.可提供終點檢測、動力學、單孔掃描和光譜掃描等測讀模式；4.分析功能擴大。本文檔共49頁；當前第30頁；編輯于星期三\3點23分多功能酶標儀的實驗應用舉例

DNA/RNA定量和純度檢測

Bradford/Lowry實驗

細胞活性/細胞毒性檢測

MTT分析（IC50/LD50）細菌生長分析

鈣流檢測

膜電位檢測

雙熒光素酶報告基因分析

本文檔共49頁；當前第31頁；編輯于星期三\3點23分多功能酶標儀的實驗應用ATP檢測

微生物生長綠熒光蛋白分析藥代毒性分析膜滲透分析熒光偏振分析

本文檔共49頁；當前第32頁；編輯于星期三\3點23分三、酶標儀操作

1.注意事項

2.酶標板

3.操作要點本文檔共49頁；當前第33頁；編輯于星期三\3點23分1.注意事項1）反復研讀試劑盒說明，熟悉操作步驟。2）加樣的準確性。操作中須注意顯色劑和終止的加量準確，最好使用加樣槍加液以保證比色時吸光度的準確性。槍頭不要混用。3）洗滌時間。一般按照說明書要求，起碼洗滌5次，切要把殘液甩干。本文檔共49頁；當前第34頁；編輯于星期三\3點23分4）觀察和判讀吸光度結果應在15min內完成，否則液體顏色會減退。5）待測生物樣品要放在4℃冰浴上。6）顯色液要現用現配，避光低溫保存。7）注意購買抗體的保存。本文檔共49頁；當前第35頁；編輯于星期三\3點23分2.酶標板本文檔共49頁；當前第36頁；編輯于星期三\3點23分酶標板材料可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體，如纖維素、交聯右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板。由于微量反應板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應用。本文檔共49頁；當前第37頁；編輯于星期三\3點23分酶標板材料國產聚苯乙烯微量反應板（上海塑料三廠出品）目前已大量應用于ELISA測定，并且獲得了滿意的結果。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質有關。特別是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至完全喪失吸附能力。本文檔共49頁；當前第38頁；編輯于星期三\3點23分酶標板鑒定對每批制品在使用前，必須經過實驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板抽樣，用檢測試劑盒進行試驗，當顯色并終止反應后，在酶標比色計中測定其O.D值。本文檔共49頁；當前第39頁；編輯于星期三\3點23分一般認為全板中每兩孔間O.D值的誤差不超過10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格。本文檔共49頁；當前第40頁；編輯于星期三\3點23分酶標儀單、雙波長檢測

一般的酶標儀在測定中均有單波長和雙波長的模式，為什么呢？本文檔共49頁；當前第41頁；編輯于星期三\3點23分酶標儀是垂直光路，受被測樣本液面是否水平、酶標板透光性、孔底是否平整等的影響較大。選擇630nm為參比波長,測定其吸光度A0;在測定波長（如490nm/450nm）下測定樣本的吸光度A,雙波長測定后,取二者的差值,測定結果的標準偏差比單波長下測定的要小,實驗誤差小。本文檔共49頁；當前第42頁；編輯于星期三\3點23分在ELISA測定所使用的底物如鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，顯色終止后，在630nm處的吸光度值都只有吸收峰處（490nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用雙波長檢測，不會影響檢測靈敏度。一般酶標儀比色應該首選雙波長。本文檔共49頁；當前第43頁；編輯于星期三\3點23分酶標儀的工作環(huán)境1.儀器應放置在無強磁場和干擾電壓的位置。2.儀器應放置在噪音低于40分貝的環(huán)境下。3.為延緩光學部件的老化，應避免陽光直射。4.操作環(huán)境溫度應在15~40℃之間，環(huán)境濕度在15%~85%之間。5.操作時電壓應保持穩(wěn)定。6.操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽、煙塵。7.保持干燥、干凈、水平的工作臺面，以及足夠的操作空間。

本文檔共49頁；當前第44頁；編輯于星期三\3點23分3.Bio-RadModel550酶標儀操作1.接通電源，打開酶標儀開關。2.儀器開始自檢。Selfdisgonsisinprogress3.按箭頭光標到Mode,設置參數。當儀器出現setanalysismode時，按enter確定。4.選擇測定波長的類型。按箭頭光標到□D/S,按select選中，enter確定。光標出現在□Dual/□Single，選擇雙波長，按select選中，enter確定。本文檔共49頁；當前第45頁；編輯于星期三\3點23分5.選擇濾光波長，此酶標儀有四個波長：1：405nm;2:450nm;3:490nm;4:630nm。按箭頭光標到□Filt,按select選中，enter確定。光標出現在Mes=#XRef=#Y，如按光標選擇數字3，即490nm的測定波長,enter確定。再按Next,到Ref,按光標選擇參考波長，如選數字4.即為630nm，enter確定。6.選擇是否混合。按箭頭光標到□Mix,按select選中，enter確定。光標出現在□yes/□No，如光標選擇No