巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及靶向性研究【摘要】目的:構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的靶向巨噬細(xì)胞的真核表達(dá)載體。方法:PCR方法合成巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子,并將其插入帶有綠色熒光蛋白基因的真核表達(dá)載體pEGFPN1中,替代CMV啟動(dòng)子。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將其與紅色熒光蛋白真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP和RFP在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平來(lái)鑒定啟動(dòng)子的靶向性。結(jié)果:成功構(gòu)建了巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體,并且能在巨噬細(xì)胞中高效特異性地表達(dá)報(bào)告基因。結(jié)論:構(gòu)建的靶向巨噬細(xì)胞的真核表達(dá)載體能提高目的基因的表達(dá)特異性,為提高基因治療胞內(nèi)菌感染的靶向性及降低毒副作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】巨噬細(xì)胞細(xì)胞特異性動(dòng)子真核表達(dá)載體胞內(nèi)菌感染基因治療

胞內(nèi)菌感染的治療一直是臨床上棘手的問(wèn)題之一。常見(jiàn)的胞內(nèi)感染細(xì)菌主要有結(jié)核桿菌、傷寒沙門氏菌等。這些胞內(nèi)感染菌突破人體第一道防線后,在體內(nèi)首先遇到巨噬細(xì)胞的吞噬和殺滅。然而在很多情況下巨噬細(xì)胞雖能吞噬這些細(xì)菌,卻并不能徹底殺死它們,反而變成了胞內(nèi)菌的庇護(hù)所[1]。另外,由于大多數(shù)抗菌藥在細(xì)胞內(nèi)的濃度低,導(dǎo)致胞內(nèi)菌不能被有效殺滅,而且胞內(nèi)菌感染的治療療程長(zhǎng),容易導(dǎo)致毒副反應(yīng)的發(fā)生和耐藥性的出現(xiàn),更使其治療困難。因此,針對(duì)胞內(nèi)菌感染的治療,新型抗菌藥物和治療方法的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用顯得尤其重要。我們前期成功構(gòu)建了抗菌肽基因的真核表達(dá)載體,并在小鼠巨噬細(xì)中成功表達(dá)了抗菌肽,發(fā)揮了殺滅胞內(nèi)菌的作用(待發(fā)表)。但是由于抗菌肽具有一定的毒副作用,會(huì)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。為了減少抗菌肽對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的毒副作用,增強(qiáng)目的基因表達(dá)的特異性和基因治療的靶向性,本研究中我們構(gòu)建了巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的靶向巨噬細(xì)胞的真核表達(dá)載體,并利用綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白作為報(bào)告基因研究了該啟動(dòng)子在不同種類細(xì)胞中表達(dá)的特異性。

1材料和方法

材料

真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN1和pERFPN1為Clontech公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5α由本室保存。高保真聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶、

DNAmarker等購(gòu)自大連TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶VspI和KpnI購(gòu)自上海生工生物有限公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取和RNA提取試劑盒購(gòu)自上海華舜公司。Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。小鼠巨噬?xì)胞株、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人乳腺癌細(xì)胞株ZR7530、非洲綠猴腎細(xì)胞株COS7均由本室保存。

方法

引物的設(shè)計(jì)與合成及巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的拼接合成根據(jù)GenBank和參考文獻(xiàn)報(bào)道的巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)拼接引物,序列為P1:5′GGCGCATTAATAAGCGACTTCCTCTTTCCAGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3

′,P2:5′ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCAAGGCAACCACAGAGTTTGG3′,P3:5′

ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3′,P4:5′CTTCTCCTTTT

CTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCAAGGCAACCACAGAGTTTG3′,P5:5′CTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTTACCCTCCC3′

,P6:5′GAGGAAGTCGCTTTTGTCGCGGTCGGGACAGGGGGCAGGGAGGGTAAAGCGACTTCC3′,P7:5′

GCGACAAAAGCGACTTCCTCTTTCCAGTGCATTTAAGGCGCAGCCTGGAAGTGCCAGG3′,P8:5′GGGGTACCGCTAGCGACTGGGTGGCCTCCAGTGCTCCCTGGCACTTCCAGGCTGCG3′。其中劃線處分別為為VspI和KpnI的酶切位點(diǎn),引物由上海生工生物有限公司合成。以P1和P8為引物,P2～P7為模版通過(guò)PCR

方法拼接合成巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列,反應(yīng)條件如下:98℃10s,68℃30s,共30個(gè)循環(huán);72℃5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠

電泳檢測(cè)。

巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子的克隆及測(cè)序鑒定

PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠回收試劑盒純化,與真核表達(dá)載體pEGFPN1用VspI和KpnI進(jìn)行雙酶切,酶切

片段回收后16℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物用氯化鈣方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,菌落PCR方法篩選陽(yáng)性菌落,提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,并送測(cè)序。測(cè)序正確的載體命名為pSPGFP。

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人乳腺癌細(xì)胞株ZR7530、非洲綠猴腎細(xì)胞株COS7用含有100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,在37℃50mL/LCO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1d鋪24孔板,次日將質(zhì)粒pSPGFP和pERFPN1按摩爾比1∶1混合,按轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達(dá)。

2結(jié)果

結(jié)巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子的拼接合成

通過(guò)拼接PCR方法合成了巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列,片段大小為350bp左右,與理論預(yù)測(cè)大小相符。

巨噬細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體的構(gòu)建和酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入真核表達(dá)載體pEGFPN1,替代CMV啟動(dòng)子得到重組表達(dá)載體。

對(duì)重組載體進(jìn)行VspI和KpnI雙酶切鑒定,得到1條約350bp的DNA片段,與理論預(yù)測(cè)值一致。經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確,命名為pSPGFP。

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中GFP的表達(dá)

重組質(zhì)粒pSPGFP與內(nèi)參對(duì)照質(zhì)粒pERFPN1按等摩爾比共轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞株。作為內(nèi)參的報(bào)告基因RFP在各細(xì)胞株中均為高表達(dá)。GFP則僅在小鼠巨噬細(xì)胞中高表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度與RFP相近;而在其他非巨噬細(xì)胞中,GFP幾乎沒(méi)有表達(dá)。這說(shuō)明我們構(gòu)建的巨噬細(xì)胞特異性載體能夠靶向巨噬細(xì)胞高效表達(dá)報(bào)告基因GFP。

3討論

采用基因治療的方法來(lái)治療胞內(nèi)菌感染,尤其是難治性胞內(nèi)菌感染,是一種新型有效的治療策略。但是,由于基因治療的載體往往缺乏靶向性,當(dāng)載體進(jìn)入機(jī)體后表達(dá)的目的基因往往會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用,造成機(jī)體損傷。所以,基因治療的靶向性是決定基因治療成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)之一,也是目前基因治療的研究熱點(diǎn)。

巨噬細(xì)胞靶向性的基因表達(dá)的主要機(jī)制就是用巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)目的基因的表達(dá),使目的基因的表達(dá)僅限于巨噬細(xì)胞,從而減輕其對(duì)正常組織細(xì)胞的損傷?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化等[3,5,6]疾病的治療研究。

在本實(shí)驗(yàn)中,我們合成了巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列,并以之替代pEGFPN1載體的CMV啟動(dòng)子,成功構(gòu)建了巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體pSPGFP。通過(guò)轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞和多種非巨噬細(xì)胞,觀察GFP表達(dá)效率來(lái)驗(yàn)證該啟動(dòng)子的巨噬細(xì)胞靶向性。為了平衡各實(shí)驗(yàn)組間的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率等因素的差異對(duì)GFP表達(dá)的影響,本實(shí)驗(yàn)中我們利用表達(dá)紅色熒光蛋白的pERFPN1載體作為轉(zhuǎn)染的內(nèi)參照,與重組載體共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞,通過(guò)比較GFP和RFP的表達(dá)差異來(lái)判斷啟動(dòng)子的表達(dá)特異性。此方法比單獨(dú)使用GFP[7,8]更準(zhǔn)確。而與利用海腎螢光素酶等作為內(nèi)參照的雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)相比,該方法更簡(jiǎn)變、更直觀而且無(wú)需特殊的檢測(cè)儀器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)的GFP可以在巨噬細(xì)胞中高效表達(dá),在非巨噬細(xì)胞中則幾乎沒(méi)有表達(dá);而以CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的RFP在巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)。這說(shuō)明我們構(gòu)建的巨噬細(xì)胞特異性真核表達(dá)載體可以在巨噬細(xì)胞中特異性的表達(dá)目的基因,為靶向巨噬細(xì)胞的基因治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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