化學發(fā)光免疫分析儀

學術資料

制作：侯恒紅

北京邁力德科技有限公司

垂詢電話:010-8123822913653114157免疫學檢測發(fā)展簡介

免疫學檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學發(fā)光物質等對檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質、激素等微量物質。免疫分析經歷了放射免疫檢驗、熒光免疫檢驗、酶標免疫檢驗等不同時期，化學發(fā)光免疫檢驗是免疫分析發(fā)展的一個新階段，它環(huán)保、快速、準確的特點已得到人們的普遍認識。

因此化學發(fā)光免疫分析是通往免疫檢驗完美境界的必經之路。

表1.1中國免疫診斷現(xiàn)狀

中國國際（歐美為主）放射免疫法（ＲＩＡ）．興起于20世紀70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院；．產品處于衰退期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，試劑基本系列化。．興起于20世紀60年代，現(xiàn)已基本退出臨床應用；．產品生命周期已終結；．廠商試劑和儀器共同開發(fā)，試劑基本系列化。酶聯(lián)免疫法（ＥＬＩＳＡ）．興起于20世紀80年代，現(xiàn)普遍使用于各級臨床機構，為我國臨床免疫診斷的基本方法；．產品處于成熟期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，試劑尚未系列化。．興起于20世紀70年代，現(xiàn)仍在臨床應用；．產品處于衰退期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，試劑基本系列化。化學發(fā)光免疫法（ＣＬＩＡ）．導入于20世紀90年代，現(xiàn)個別較大醫(yī)院開展個別項目；．產品處于導入期或成長期；．無廠商開發(fā)生產，完全依賴進口．興起于20世紀80年代，現(xiàn)已被臨床普遍使用，成為臨床免疫診斷的支柱方法；．產品處于成熟期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，儀器自動化程度高，試劑系列化狀態(tài).化學發(fā)光免疫分析技術原理化學發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA）是將化學發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應相結合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。化學發(fā)光是在常溫下由化學反應產生的光的發(fā)射。其機制為某些化合物（發(fā)光劑或發(fā)光底物）可以利用一個化學反應產生的能量使其產物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子激態(tài)。當此產物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。免疫測定(immunoassay)是利用抗原體反應來測定標本中微量物質的方法。1.使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

3.洗滌后加入發(fā)光底物，酶促使發(fā)光底物發(fā)光，通過專用的儀器檢測光子的數(shù)量，從而反算出未知抗原或抗體的濃度?；瘜W發(fā)光免疫檢測原理在化學發(fā)光免疫分析，其基本原理同酶聯(lián)免疫技術（ELISA），常采用雙抗體夾心法、競爭法、等反應模式，

圖1.2雙抗體夾心法反應原理示意圖

化學發(fā)光免疫檢測原理歷史發(fā)展產品的對比：

1、化學發(fā)光與酶免的對比

2、化學發(fā)光與放免的對比

3、化學發(fā)光與時間分辯熒光檢測的對比

4、化學發(fā)光的突出優(yōu)點化學發(fā)光與酶免的對比酶免原理：1.使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。3.洗滌后加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。

化學發(fā)光免疫檢測的靈敏度與可測范圍遠遠高于酶免產品，兼具ELISA法簡便的操作方法與較短的反應時間。

化學發(fā)光與酶免的對比表：酶標化學發(fā)光測量精度定性/半定量測量定量測量人體傷害底物有致癌性無有效期較長長干擾因素較多極少測試項目少多化學發(fā)光與放免的對比放免原理是使用具有放射性的I125作標記物，然后用測量射線計數(shù)儀放射性（125I）。對環(huán)境的污染及對身體的危害，已經為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）125I的半衰期短而導致其試劑有效期短標記物125I的穩(wěn)定性差，導致試劑盒批間、批內的變異較大；標準曲線有效期短，必須每次定標，造成浪費。

操作繁瑣，出報告時間長?；瘜W發(fā)光與放免的對比表：放免化學發(fā)光測量精度較高高人體傷害放射性無有效期較長長干擾因素較多極少測試項目較多多化學發(fā)光與時間分辨的對比：

時間分辨免疫檢測原理和化學發(fā)光基本一樣，只是標記物改為稀土元素，不用發(fā)光底物但需要外在的穩(wěn)定光源照射，光的波長產生stoke位移，并有一個時間滯后以便于檢測波長改變后的光子數(shù)量。

1、化學發(fā)光成本低于時間分辨熒光免疫分析。

2、化學發(fā)光比時間分辨熒光免疫試劑盒更穩(wěn)定

3、化學發(fā)光免疫分析試劑盒對對測試環(huán)境條件要求低。

4、化學發(fā)光不需要外光源，儀器可靠性更高化學發(fā)光與時間分辯熒光的對比：化學發(fā)光時間分辯熒光標記物酶-發(fā)光底物兩級放大稀土離子，如銪穩(wěn)定性穩(wěn)定性非常好影響被標記物的生物活性與免疫活性靈敏度靈敏稍高于化學發(fā)光反應體系接近中性酸性，易引起蛋白質變性包被技術不透明微量孔壁吸附,提高分析靈敏度,降低本底采用透明微量孔壁吸附，孔壁的透明度會引起,本底干擾技術性新技術，很成熟新技術，不成熟干擾因素干擾極小容易受內外源稀土離子的干擾測試項目

項目齊全(見試劑報價單)缺少部分項目。如：貧血（葉酸，鐵蛋白，維生素B12）化學發(fā)光免疫分析的優(yōu)點：

1．靈敏度高：這是CLIA關鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達10-16mol/L（RIA為10-12mol/L）。又如化學發(fā)光底物（如AMPPD）可檢測出的堿性磷酸酶的濃度比顯色底物要靈敏5х105倍。2．寬的線性動力學范圍：發(fā)光強度在4～6個量級之間與測定物質濃度間呈線性關系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（OD值）為2.0的范圍相比，優(yōu)勢明顯。雖然RIA也有較寬的線性動力學范圍，但放射性限制了其應用。3．光信號持續(xù)時間長：輝光型（glowtype）的CLIA產生的光信號持續(xù)時間可達數(shù)小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量?；瘜W發(fā)光免疫分析的優(yōu)點：

4．分析方法簡便快速：絕大多數(shù)分析測定均為僅需加入一種試劑（或復合試劑）的一步模式。

5．結果穩(wěn)定、誤差?。簶悠废抵苯幼约喊l(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結果靈敏穩(wěn)定可靠。6．安全性好及使用期長：在上述優(yōu)點前提下，更免除了使用放射性物質。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)CLIA的危害性。有效期可長達1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰變，一般有效期只有一個月，而酶聯(lián)的底物貯存性差，都無法與化學發(fā)光相比，有效期長可以提高勞動效率，也利于推廣應用。

總結綜合以上優(yōu)點，目前已有的各種免疫分析尚沒有出其右者，現(xiàn)在國外發(fā)達國家在CLIA的研究和開發(fā)方面進展很快，已有全自動的化學發(fā)光（閃光型和輝光型）與電化學發(fā)光免疫分析等系列產品。我國在化學發(fā)光免疫分析方面的研究還比較落后，這就是我國急需研究和發(fā)展CLIA的原因。

基本性能對照表【化學發(fā)光免疫分析種類】

1.直接化學發(fā)光A吖啶酯發(fā)光原理：納米磁珠分離后的吖啶酯標記的抗原抗體復合物，在含H2O2的強酸、強堿激發(fā)底物的作用下，快速發(fā)出可見光，通過光電倍增管進行光子計數(shù)，相對光強度RLU與待測抗原濃度成函數(shù)關系。特點：發(fā)光過程在5秒內完成，激發(fā)發(fā)光程序簡單，測試速度快，但發(fā)光標記物吖啶酯在緩沖液中不穩(wěn)定，易水解，影響試劑穩(wěn)定性。代表儀器：拜耳公司的ACS180?！净瘜W發(fā)光免疫分析種類】B異魯米諾發(fā)光原理：發(fā)光過程和原理與吖啶酯完全相同，但激發(fā)發(fā)光速度更快，在3秒內完成整個過程，測試速度最快，而且克服了吖啶酯在緩沖液不穩(wěn)定、易水解的缺點。代表儀器：德國Byk–Sangtec公司的LIAISONC電化學發(fā)光原理：納米磁珠分離后的三聯(lián)吡啶釕標記的抗原抗體復合物，在三丙胺的作用下，發(fā)生氧化還原反應，發(fā)出可見光，通過光電倍增管進行光子計數(shù)，相對光強度RLU與待測抗原濃度成函數(shù)關系。特點：激發(fā)發(fā)光過程復雜，時間長，每一個發(fā)光過程約需25秒，測試速度慢。代表儀器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS1010和ELECSYS2010?！净瘜W發(fā)光免疫分析種類】2、酶促化學發(fā)光或持久發(fā)光原理：酶促化學發(fā)光一般是將堿性磷酸酶標記在抗體或抗原上，納米磁珠分離后的堿酶標記的抗原、抗體復合物在發(fā)光底物AMPPD作用下，持續(xù)發(fā)出可見光，通過光電倍增管讀取光信號。特點：激發(fā)發(fā)光時間長，測試速度慢，因為酶易受環(huán)境溫度的影響，試劑的穩(wěn)定性不如直接化學發(fā)光好。代表儀器：美國貝克曼公司的ACCESS，雅培公司的AXSYM?？灯丈瘜W發(fā)光免疫分析儀的性能特點

1、先進的測定方法

利用高靈敏度的化學發(fā)光技術作為測定方法。

2、高效的集成設計

臺式系統(tǒng)、占用空間更少、方便操作與保養(yǎng)。精密三維傳動、低損耗光纖傳輸，確保優(yōu)良的儀器性能及低噪音運行。

3、實用的功能界面

利用最流行的WIN界面。吸收眾家設計之精華、融入多年院方之經驗，實現(xiàn)復雜產品簡單操作，適合臨床使用。4、開放的工作模式

3－96個樣品測試，數(shù)量任選，即適合批量測試，又適于小型醫(yī)院、少量患者或急診情況隨機測試。

5、優(yōu)秀的的數(shù)據(jù)分析方法

內置多種格式擬合方法?？捎蓛x器自定，也可由操作人員選定，標準曲線數(shù)據(jù)與圖形隨時可顯示與打印。

6、單板多項功能

本系統(tǒng)采用標準96孔板，最多可以12個項目在一塊孔板上同時檢測，極大的提高了檢測效率。7、易學易用的軟件

根據(jù)國內醫(yī)院的使用習慣，采用人機對話軟件界面，簡單、易學易用。

8、系統(tǒng)安全保護及自診斷功能

當操作危及系統(tǒng)安全時，系統(tǒng)會及時提示并停止運行，以確保儀器安全。當儀器出現(xiàn)故障時，系統(tǒng)會自行診斷并提示故障類型。與國外化學發(fā)光儀器的比較儀器價格便宜；國外全自動化學發(fā)光分析儀器報價一般都在百萬左右。試劑成本低；國外試劑每個測試的成本最低也要15元左右，而我們每個測試的最高成本也就在10元左右。國外儀器界面一般都是英文界面，使用學習非常不便；我們的是全中文界面，人性化設計，符合國人使用習慣?？旖萁洕氖酆蠓?。國外儀器售后服務反應慢，價格高昂，配件價格極高。舉例說明陜西省人民醫(yī)院2002購置了一臺美國拜耳公司生產的發(fā)光免疫分析儀，因檢測費用較高，有消費能力的患者較少，又因進口試劑是大包裝，保質期較短。僅試劑一項去年就損失了8萬多元人民幣。后來通過多方面交涉，退回了分析儀。目前的試劑種類：化學發(fā)光免疫分析儀實力強勁：★高度敏感，極限達10-17mol/l,遠高于RIA、EIA，與TRFIA相當，但比TRFIA便宜?！锾禺愋詮姟镏貜托院肅.V.<5%★測定范圍寬，可達7個數(shù)量級?！镌噭┓€(wěn)定性好，無污染。甲胎蛋白（AFP）人/次6/10化學發(fā)光、時間分辨法60元/次癌胚抗原（CEA）人/次6/10化學發(fā)光、時間分辨法60元/次血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）人/次15

化學發(fā)光、時間分辨法40元/項血清