PAGEPAGE18技術(shù)報告一、立題依據(jù)及指導(dǎo)思想近20年來，隨著我國畜牧業(yè)的繁榮和發(fā)展，國內(nèi)畜禽的飼養(yǎng)環(huán)境與飼主的飼養(yǎng)觀念以及生產(chǎn)成本高漲的壓力下，密飼已成為不正確的趨勢，加上衛(wèi)生管理上的缺失，疾病的發(fā)生日趨復(fù)雜化，獸藥(包括藥物添加劑)的使用日益廣泛，獸藥的使用無疑會導(dǎo)致獸藥及其代謝產(chǎn)物在動物體內(nèi)的滯留或蓄積，并以殘留的方式進入人體及生態(tài)系統(tǒng)。獸藥殘留問題不僅涉及到廣大人民群眾的生命安全與健康，還涉及到生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)的經(jīng)濟利益和國家經(jīng)濟的發(fā)展。去年以來，各地多寶魚事件、"紅心"鴨蛋事件、"瘦肉精"中毒等食品安全事件頻發(fā)，食品安全問題導(dǎo)致我國農(nóng)產(chǎn)品、食品國際貿(mào)易屢次受阻，損害了出口信譽和國家形象。目前，中國的食品已經(jīng)出口到全球２００多個國家和地區(qū)。２００６年中國出口食品２４１７.３萬噸，貨值２６６.５９億美元。近期，寵物食品和食品安全事件的出現(xiàn)，使中國的產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全狀況備受關(guān)注。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展和社會的進步，食品生產(chǎn)經(jīng)營和消費格局的變化，以及經(jīng)濟和貿(mào)易的全球化，食品安全監(jiān)管工作面臨一些新形勢。公眾對食品安全的關(guān)注度將繼續(xù)增加，食品安全事件極易引起全社會的廣泛關(guān)注。要提高畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，確保畜禽產(chǎn)品的安全，除了嚴格控制疫情、加強飼養(yǎng)管理和對獸藥及添加劑殘留的監(jiān)測與控制外，開發(fā)出新型的可替代抗生素的抗菌肽飼料原料和添加劑至關(guān)重要。由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對分子量較小、熱穩(wěn)定、水溶性好等優(yōu)點，更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒有作用，僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，在當(dāng)前不少病原菌對原有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性時。應(yīng)用無毒無公害的新型抗菌劑代替抗生素作飼料添加劑，已成為當(dāng)前國內(nèi)外飼料學(xué)科的一項重要內(nèi)容?？股刈黠暳咸砑觿﹪乐赜绊懶螽a(chǎn)品在國際市場的競爭力，應(yīng)用生物技術(shù)研究與開發(fā)新型抗菌劑是我國科學(xué)界一項緊迫的任務(wù)。本項目用牛糞和食用菌渣等農(nóng)業(yè)廢料通過發(fā)酵處理成蚯蚓喜食的餌料，規(guī)?；a(chǎn)鮮蚯蚓。將收集到的鮮蚯蚓用超聲誘導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)蚯蚓抗菌肽的高表達。然后將超聲處理抗菌肽高表達的蚯蚓勻漿后離心,用超濾的方法截留分子質(zhì)量小于1ku的粗組分。經(jīng)過超濾截流的粗組分用陽離子交換劑SP-SepharoseFastFlow和蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)分析PharmarciaFPLC系統(tǒng)收集抗菌肽，并得到純化的抗菌肽。純化的抗菌肽用電噴霧離子源質(zhì)譜(ESI-MS)測其分子質(zhì)量及純度。接著用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS法，BrukerESQUIRE-LC/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)測定抗菌肽的氨基酸序列，用水將樣品溶解后直接上樣,電噴霧離子源，測定其的氨基酸序列?？咕V檢測用微量稀釋法，參照天津金章醫(yī)用新技術(shù)研究所MIC試劑盒說明書。通過上述檢測完成對蚯蚓抗菌肽的定性、定量和抗菌活性結(jié)構(gòu)分析。然后將表面活性劑、助表面活性劑、油、水、抗菌肽等組分在適當(dāng)條件下，形成油包水型（W/O）的外觀透明、低粘度，熱力學(xué)穩(wěn)定體系抗菌肽微乳液?？紤]生產(chǎn)成本和市場化問題，因為蚯蚓消化道中有10多種蛋白水解酶如蚯蚓纖溶酶,這些蛋白酶類對蛋白質(zhì)有較強的水解活性,可使蛋白質(zhì)發(fā)生水解作用,選擇適宜的酶解條件,使蚯蚓體內(nèi)酶保持較高活性,并利用這些酶水解體蛋白,使之變成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,作為添加劑可以直接被其它動物體完整地吸收,發(fā)揮其促生長及抗病的作用。為了進一步利用蚯蚓營養(yǎng)肽,本研究對蚯蚓營養(yǎng)肽的性質(zhì)及功能進行了深入研究,以研究其促進動物生長及防病的機理,并為其進一步的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。以"蚯蚓生態(tài)鏈"為核心，創(chuàng)立肉牛生態(tài)養(yǎng)殖新模式，形成高效的"肉牛-牛糞-蚯蚓-蚯蚓抗菌肽-有機肉牛生產(chǎn)"生態(tài)鏈并延伸成產(chǎn)業(yè)化鏈，開發(fā)出無毒無公害的新型促進動物生長及防病的蚯蚓營養(yǎng)肽作為飼料添加劑。二、課題研究的主要內(nèi)容1.主要技術(shù)路線牛糞、食用菌渣等發(fā)酵處理用作蚯蚓餌料牛糞、食用菌渣等發(fā)酵處理用作蚯蚓餌料蚯蚓的工廠化飼養(yǎng)超生誘導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)蚯蚓抗菌肽的高表達用超濾的方法截留分子質(zhì)量小于1ku的粗組分陽離子交換劑（SP-SepharoseFastFlow）和蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)分析系統(tǒng)收集抗菌肽利用微乳化技術(shù)對抗菌進行處理生產(chǎn)抗菌肽微乳液電噴霧離子源質(zhì)譜測抗菌肽分子質(zhì)量及純度串聯(lián)質(zhì)譜測定抗菌肽的氨基酸序列抗菌譜檢測動物飼養(yǎng)試驗營養(yǎng)肽的性質(zhì)分析及功能分析2、創(chuàng)新點利用微乳化技術(shù)處理抗菌肽，制備的抗菌肽微乳液，微乳液粒徑大小都在10-100nm以下，形成納米級的抗菌肽微乳液粒，有利于動物機體吸收。且粒徑大小隨時間變化不大，穩(wěn)定性好，制備簡單，常溫下貯藏，微乳化的抗菌肽損失隨時間變化很小?？咕耐ㄟ^微乳化形成油包水的微乳液粒，使其免受胃蛋白酶等消化酶的酶解作用，還有胃酸的腐蝕作用。利用蚯蚓消化道中有10多種蛋白水解酶，可使蚯蚓本身蛋白質(zhì)發(fā)生水解作用,使之變成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,開發(fā)出促生長及抗病的蚯蚓營養(yǎng)肽。3、本研究的主要難點在于=1\*GB2⑴對蚯蚓利用工程菌采用超聲技術(shù)進行抗菌肽高表達誘導(dǎo)。采用誘導(dǎo)方法制取蚯蚓抗菌寡肽，這是一條與“基因工程”方法制取抗菌肽完全不同的途徑,對發(fā)展生物制藥具有重要意義。=2\*GB2⑵抗菌肽的超濾和提取。用超濾法與離子交換層析相結(jié)合的蚯蚓抗菌肽制備方法，簡便易行、收獲率和純度高,從蚯蚓(Eiseniafoetida)體中分離得到抗菌肽,發(fā)現(xiàn)的抗菌寡肽的結(jié)構(gòu)特點,找出蚯蚓抗菌寡肽族的氨基酸組成。=3\*GB2⑶利用微乳化技術(shù)處理抗菌肽。微乳化通過以Tween80表面活性劑、正丁醇為助表面活性劑、油、水、抗菌肽等組分在適當(dāng)條件下，外觀透明、低粘度，熱力學(xué)穩(wěn)定體系。形成油包水型（W/O）的抗菌肽微乳液。微乳液是一種水和油在大量表面活性劑及助表面活性劑(一般為中等鏈長的醇)存在下自發(fā)形成的透明或半透明的體系。分散相質(zhì)點為球形，但半徑非常小，通常在10～100nm范圍，是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。進入20世紀90年代之后，因為微乳液具有外觀透明、穩(wěn)定性好、易于制備、粒徑小且均勻等優(yōu)點開始作為藥物載體在藥學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用。=4\*GB2⑷蚯蚓本身發(fā)生酶解條件的控制利用蚯蚓消化道中有10多種蛋白水解酶，可使蚯蚓本身蛋白質(zhì)發(fā)生水解作用,使之變成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,開發(fā)出促生長及抗病的蚯蚓營養(yǎng)肽。如果條件控制不好發(fā)生過酶解或酶解不全。三、主要儀器設(shè)備電子分析天平ARI140HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋超凈臺高壓蒸汽滅菌鍋恒溫培養(yǎng)箱，超濾杯系統(tǒng)(頗爾-格爾曼,美國)，高速低溫離心機(HitachiCR21,日本)，冷凍干燥機(FTSSYSYTEMTM,TDS-3D-MP,Revco,德國)，BrukerESQUIRE-LC/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，MIC空白板及對應(yīng)的結(jié)種器(天津金章醫(yī)用新技術(shù)研究所)，PharmarciaFPLC系統(tǒng),SP-SepharoseFastFlow;ProRPCTMHR5/10預(yù)裝柱(Pharmacia,瑞典)。四實驗方法1、蚯蚓生產(chǎn)牛糞和食用菌渣等農(nóng)業(yè)廢料通過EM菌液發(fā)酵處理，處理成蚯蚓喜食的餌料，將餌料和種蚓投放到蚯蚓生物反應(yīng)器上。2、對蚯蚓進行抗菌肽高表達誘導(dǎo)將從蚯蚓生物反應(yīng)器上收集到的蚯蚓加入少量水,用超聲誘導(dǎo)(額定功率80W),誘導(dǎo)處理15min的時間。3、抗菌肽的分離純化=1\*GB2⑴粗樣品的制備將用超聲處理抗菌肽高表達的蚯蚓用0.02mol/L(pH6.0)磷酸緩沖液(PB)勻漿后離心,取上清并計算30%飽和度所需要的固體硫酸銨量,研細后于4℃=2\*GB2⑵陽離子交換分離陽離子交換劑SP-SepharoseFastFlow,緩沖液A為0.01mol/L乙酸銨緩沖液(pH5.45),緩沖液B為1.0mol/L乙酸銨緩沖液(pH5.45).用緩沖液A平衡,上樣后用緩沖液A洗脫到出現(xiàn)基線,而后進行梯度洗脫0%-100%B洗脫300ml。收集各峰并取少量進行抗菌活性檢測。抗菌實驗表明,60%飽和度的硫酸銨沉淀分子質(zhì)量<1ku的蛋白質(zhì)粗組分,對白色念株菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯菌有抗菌活性,,對卡他布蘭漢氏球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯氏菌有抗菌活性。=3\*GB2⑶反相快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)分析反相快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)分析PharmarciaFPLC系統(tǒng),ProRPCTMHR5/10預(yù)裝柱,緩沖液A為0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液緩沖液B為0.085TFA/70%乙腈(乙腈∶水為70∶30)，0%-50%B洗脫40ml(或0%-30%B洗脫24ml)，洗脫后的樣品真空干燥。陽離子交換分離得到兩種組分T-1與T-2，T-1與T-2的分子質(zhì)量都小于1ku。在相同的緩沖液梯度中從陽離子交換柱中洗脫出來,這說明T-1與T-2的等電點、離子特性非常相似。在FPLC分析中,T-1與T-2是臨近的兩個峰,分離純化的結(jié)果表明T-1與T-2是在離子特性和疏水特性等方面非常相似的兩種活性成分。純度及分子質(zhì)量測定:只要質(zhì)量有差異的雜質(zhì)都可以用質(zhì)譜法檢測出來，靈敏度高且用量少。T-1與T-2的質(zhì)譜分析表明T-1與T-2已經(jīng)得到了純化。用ESI-MS測定多肽的相對分子質(zhì)量精確度可達0.1%-0.01%，遠比其他方法(如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠過濾、超離心等)精確。T-1與T-2的相對分子質(zhì)量為535.27和519.27。氨基酸序列測定:利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MS/MS)T-1與T-2得了肽的結(jié)構(gòu)信息。T-1包含丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、纈氨酸(Val)和兩個絲氨酸(Ser),5個氨基酸殘基的分子質(zhì)量之和為493.26,現(xiàn)加一個乙酰基(Ac42),正好為T-1的相對分子質(zhì)量535.27,證明該肽被乙?；忾]。T-2的MS/MS質(zhì)譜分析表明,T-2包含丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)和蘇氨酸(Thr),5個氨基酸殘基的分子質(zhì)量之和為477.26,現(xiàn)加一個乙?；?正好為T-2的相對分子質(zhì)量519.27,證明該肽被乙?；忾]。質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明T-1的肽序列為Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser。質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明T-2的肽序列為Ac-Ala-Met-Val-Gly-ThT-1與T-2的N端均被乙?；忾],N端的3個氨基酸殘基(丙氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸)相同。T-1的C端是兩個絲氨酸殘基,而T-2是甘氨酸和蘇氨酸殘基,絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸都是不帶電荷的極性R基氨基酸。T-1與T-2有很高的同源性。4、抗菌譜檢測4.1實驗材料原料：大平2號蚯蚓菌種名稱及來源菌種名稱及來源如表所示菌種名稱來源菌種類型培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌實驗室G+細菌肉湯枯草芽孢桿菌實驗室G+細菌肉湯大腸桿菌實驗室G-細菌肉湯鏈球菌實驗室G+細菌肉湯變形桿菌實驗室G-細菌肉湯皮氏伯克霍爾德菌實驗室G-細菌肉湯4.2培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基配方為蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl10%，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基添加1%的瓊脂。37℃培養(yǎng)。4.3抗菌肽的微乳化在35℃下，Tween80:正丁醇=1:1；抗菌肽、油、水為1:99:9994.4抑菌效果的檢測采用瓊脂擴散紙片法A接種待測菌種在超凈臺上分別將各種待測菌種用接種針密致劃線接種在預(yù)先做好的瓊脂平板培養(yǎng)基上，每一種待測菌種接種在一個平板上。B抗菌肽紙片的制備將準備好的5mm直徑圓形的濾紙片用無菌鑷子浸在試管中的抗菌肽原溶液中，然后拿出來涼干。C用無菌鑷子將浸出液濾紙片放在瓊脂平板培養(yǎng)基的表面，（注意各個紙片之間的距離）。D將貼好濾紙片的培養(yǎng)基放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察測量抑菌圈直徑。直徑大者抑菌作用強，反之亦然。4.5蚯蚓抗菌肽的熱穩(wěn)定性的檢測將蚯蚓浸出液原液分別在100℃滅菌0，5，10，30min，用滅菌時間不同浸出液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌做抑菌檢測。4.6蚯蚓抗菌肽對不同待測菌種的抑菌效果的比較選擇了皮氏伯克霍爾德菌、變形桿菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌以及大腸桿菌等5種菌和金黃色葡萄球菌一起做對照實驗發(fā)現(xiàn):蚯蚓浸出液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、皮氏伯克霍爾德菌、變形桿菌、鏈球菌均有抑菌效果，對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最強，對皮氏伯克霍爾德菌抑菌效果最弱。結(jié)果見表1。表1蚯蚓抗菌肽對不同菌種的抑菌效果供試菌種抑菌圈直徑/mm金黃色葡萄球菌9.0枯草芽孢桿菌12.6大腸桿菌11.0鏈球菌7.8變形桿菌5.7皮氏伯克霍爾德菌5.6表2蚯蚓抗菌肽對不同菌種的抑菌效果的對比4.7蚯蚓抗菌肽的熱穩(wěn)定性蚯蚓抗菌肽溶液分別在100℃加熱0，5，10，30min，對抗菌活性基本沒有影響，如表3所示，未經(jīng)加熱處理的蚯蚓浸出液對大腸桿菌的抑菌效果最好,經(jīng)加熱滅菌處理的蚯蚓抗菌肽隨加熱時間的增加,對大腸桿菌抑菌效果逐漸下降,加熱30min的蚯蚓浸出液對大腸桿菌而蚯蚓抗菌肽溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果逐漸上升，經(jīng)30min加熱處理的蚯蚓抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，隨著加熱時間的縮短，對經(jīng)黃色葡萄球菌的抑菌效果有所上升。

表3滅菌不同時間蚯蚓抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果蚯蚓浸出液滅菌時間/min抑菌圈直徑/mm對大腸桿菌對金黃色葡萄球菌011.09.0510.89.21010.49.43010.29.8表4不同滅菌時間蚯蚓抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果的變化4.8結(jié)論A蚯蚓抗菌肽對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、皮氏伯克霍爾德菌、變形桿菌、鏈球菌均有抑菌效果，對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最強，對皮氏伯克霍爾德菌效果最弱。B蚯蚓抗菌肽有較強的熱穩(wěn)定性，隨著滅菌時間的增長抑菌效果基本上沒有影響，經(jīng)加熱滅菌處理的蚯蚓浸出液隨加熱時間的增加,對大腸桿菌抑菌效果逐漸下降，而對于金黃色葡萄球菌，隨著加熱時間的縮短，抑菌效果有所上升。五、抗菌肽飼料添加劑對斷奶仔豬和肉仔雞生產(chǎn)的影響5.1抗菌肽飼料添加劑對斷奶仔豬豬腹瀉率和死亡率的影響。5.1.1材料與方法試驗動物選體重接近的斷奶仔豬60頭，隨機分為3組，每組20頭，公母各半，公豬去勢，個體編號，對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗Ⅰ組在基礎(chǔ)飼料中添加1%的抗菌肽飼料添加劑，試驗Ⅱ組在基礎(chǔ)飼料中添加3%的抗菌肽飼料添加劑。經(jīng)預(yù)試期后，個體稱重，試驗正式期33d。5.1.2飼料配方及營養(yǎng)水平（見表5）表5飼料配方及營養(yǎng)水平原料（％）對照組試驗Ⅰ組試驗Ⅱ組玉米58.7558.7558.25豆粕19.4819.4819.48膨化大豆8.718.718.71油脂1.941.941.94魚粉4.974.974.97抗菌肽飼料添加劑-1%3%乳清粉3.03.03.0石粉磷酸氫鈣食鹽51%預(yù)混料1.01.01.0營養(yǎng)水平消化能(MJ/kg·DM)13.79粗蛋白質(zhì)(%)18.0鈣(%) 0.81磷(%) 0.75賴氨酸(%) 1.24蛋氨酸(%) 0.32蛋氨酸+胱氨酸(%) 0.68注：預(yù)混料含各種維生素（A、D3、E、K3、B1、B2、B6、B12、煙酸、泛酸鈣、吡哆醇、膽堿），各種微量元素（Fe、Cu、Zn、Mn、Co、I、Se）。按《瘦肉豬飼養(yǎng)標準GB8487—87》配制日糧。試驗期間飼養(yǎng)管理豬舍為全封閉豬舍，斷奶仔豬飼喂粉料，喂前用水拌濕，每日4次（6:30、10:30、14:00和17:30），自由采食，自由飲水。各組分別記錄喂料量，腹瀉情況和死淘率。舍內(nèi)溫度15～22℃，地面干燥，及時清除糞便，通風(fēng)換氣，舍內(nèi)衛(wèi)生良好。5.1.3結(jié)果與分析試驗期各組腹瀉情況（見表6）結(jié)果表明：在35～50日齡階段，添加1%和3%的抗菌肽飼料添加劑，試驗Ⅰ、Ⅱ組比對照組的腹瀉率分別減少了30％和45％；51～68d期間，試驗Ⅰ、Ⅱ組比對照組的腹瀉率分別減少了28%和40%；死亡率各組均為0。添加1%和3%的抗菌肽飼料添加劑可以不同程度地降低腹瀉率，對調(diào)控消化道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)可能有一定的效果。表6日糧中添加1%和3%的抗菌肽飼料添加劑對斷奶仔豬腹瀉率和死亡率的影響（n=20）項目腹瀉次數(shù)35～50d51～68d腹瀉率（%）35～50d51～68d死亡率（%）35～50d51～68d對照組1210605000試驗I組65302200試驗II組321510005.2抗菌肽飼料添加劑對肉仔雞生產(chǎn)的影響5.2.1試驗設(shè)計選取480只健康1日齡艾維茵肉仔雞,隨機分成4組,每組4個重復(fù),試驗期為42d。試驗各組在飼喂玉米-豆粕型日糧的基礎(chǔ)上加入不同水平的抗菌肽和抗生素,藥物配伍及添加劑量見表7。表7各組藥物配伍及添加劑量組別添加物及含量試驗1組黃霉素5mg/kg+喹乙醇30mg/kg試驗2組抗菌肽1mg/kg試驗3組抗菌肽3mg/kg試驗4組抗菌肽5mg/kg5.2.2試驗日糧及飼養(yǎng)管理基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)指標見表8(參照美國NRC1994,家禽日糧營養(yǎng)需求配制而成)。表8基礎(chǔ)日糧成分及營養(yǎng)指標原料1～21d22～42d玉米/%57.059.2豆粕/%26.021.8膨化大豆/%7.29.2進口魚粉/%3.02.0石粉/%2.03.0菜油/%1.01.0NaCl/%0.220.24Lys/%0.0780.000Met/%0.2180.139預(yù)混料/%3.2843.421營養(yǎng)指標ME/(MJ·kg-1)12.3512.57CP/%20.88319.500Ca/%1.0010.939TP/%0.6510.631AP/%0.4730.458Lys/%1.1501.000Met/%0.5610.459Met+Cys/%0.9440.830注:預(yù)混料中含Zn310mg/kg,Cu21.0mg/kg,Fe113mg/kg,Mn360mg/kg,I80mg/kg,VE150mg/kg,VC50mg/kg,參照NRC(1994)。試驗前雞舍充分沖洗并消毒,試驗期間每周2次帶雞消毒。肉雞自由采食和飲水。雞舍溫度、濕度、光照和飼養(yǎng)密度依常規(guī)要求而定。5.2.2指標測定試驗期間,每天觀察記錄仔雞死亡數(shù);22和43日齡清晨,對雞進行空腹稱質(zhì)量,記錄耗料量。試驗結(jié)束時分別計算肉雞成活率、平均日增質(zhì)量和料肉比。5.2.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析采用MicrosoftExcel2000和SPSS(10.0)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準誤差表示。5.2.4結(jié)果與分析A:對肉雞成活率的影響試驗各組肉雞成活率結(jié)果見表9。由表9可見,整個試驗期,抗菌肽組肉雞成活率都高于其他2組。試驗3組肉雞在1～21d和22～42d的成活率分別比試驗1組高出3.76%和5.17%,差異顯著。試驗3組肉雞成活率也高于試驗2組,但差異不顯著。試驗4組肉雞在1～21d和22～42d的成活率顯著高于試驗1組,差異顯著;相對于試驗2組,試驗4組的成活率有上升趨勢,差異不顯著。試驗4組與試驗3組比較,肉雞成活率有下降趨勢,但差異不顯著。 表9試驗各組肉雞成活率項目試驗1組試驗2組試驗3組試驗4組成活率(21d)94.30a97.54ab98.06b98.44b成活率(42d)91.26a95.18ab96.43b97.60b注:同行數(shù)據(jù)肩注不同小寫字母表示差異顯著,肩注不同大寫字母表示差異極顯著B:對肉雞生產(chǎn)性能的影響試驗各組肉雞平均日增質(zhì)量(ADG)和料肉比(F/G)結(jié)果見表10。由表4可知,無論在飼養(yǎng)前期、后期及整個試驗期,抗菌肽添加組肉雞都表現(xiàn)出良好的生長趨勢,其中試驗4組肉雞平均日增質(zhì)量最高,略高于試驗3組,顯著高于試驗1組和試驗2組,差異顯著?？咕慕M的料肉比均略低于抗生素組,但差異不顯著。表10試驗各組平均日增質(zhì)量和料肉比結(jié)果測試項目試驗1組試驗2組試驗3組試驗4組體質(zhì)量(1d)39.00±0.0239.00±0.0239.00±0.0239.00±0.02體質(zhì)量(21d)585.00±11.31604.00±02.38613.00±11.5625.00±14.36體質(zhì)量(42d)1789±0.071989.00±0.591979.00±0.061999.00±0.35平均日增質(zhì)量(1～21d)25.00±11.3626.89±10.0526.33±12.5327.89±14.36平均日增質(zhì)量(22～42d)57.03±4.06a61.57±2.59a65.15±3.16b65.33±2.59b平均日增質(zhì)量(1～42d)41.57±5.33a44.39±4.25a46.29±6.22b46.57±4.35b料肉比(1～21d)1.46±0.371.43±0.261.38±0.551.37±0.24料肉比(1～42d)2.01±0.881.93±0.591.89±0.241.78±0.645.2.5小結(jié)試驗結(jié)果表明,在肉仔雞日糧中添加5mg/kg抗菌肽,能有效提高肉雞成活率,改善飼料消化吸收,提高肉雞的生產(chǎn)性能。由于抗生素的過度使用,細菌耐藥性正在驚人的增強。試驗觀察到,與大劑量的抗生素組合相比,抗菌肽能提高肉雞成活率及生產(chǎn)性能,很少有耐藥性產(chǎn)生。從經(jīng)濟效益上看,抗菌肽添加劑量小,作用快,成本低,可作為抗生素替代物,廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)。六、蚯蚓營養(yǎng)肽的研究6.1材料與試劑1.復(fù)合蚯蚓營養(yǎng)液:自行研制2.試劑:SephadexG-25:德國,Sigma公司SDS,PAGE,等Sigma公司進口,上海試劑廠分裝。6.2方法1.氨基酸分析:氨基酸自動分析儀分析。由河北省分析測定中心測定。2.微量元素:原子吸收法河北省分析測定中心測定。3.維生素:河北省分析測定中心測定。4.SDSPAGE電泳:參照(劉毓秀,程桂芳譯,蛋白質(zhì)的凝膠電脈法·實踐方法。1986,科學(xué)出版社)文獻的方法,濃縮膠5%,分離膠12%。6.3結(jié)果表11蚯蚓營養(yǎng)肽氨基酸分析氨基酸名稱含量mg/100ml氨基酸名稱含量mg/100ml天冬氨酸541賴氨酸660異亮氨酸474丙氨酸547蘇氨酸377組氨酸185亮氨酸604半胱氨酸124酪氨酸228精氨酸563谷氨酸985頡氨酸481苯丙氨酸406脯氨酸219甘氨酸248蛋氨酸257絲氨酸335蚯蚓蛋白含量很高，約占干重的50-65%，將其水解所獲得的混合液，其中氨基酸占85%，短肽和小分子蛋白為14%-15%。而氨基酸中以谷氨酸、賴氨酸和精氨酸的含量居多。表12酶解后蚯蚓營養(yǎng)肽的礦物質(zhì)和維生素含量礦物質(zhì)含量mg/L維生素含量mg/L鉀992維生素A13.56鐵340維生素B153.95鈣320維生素B284.02鈉315維生素E30.98鎂120維生素C382.9鋅7.1錳3.87硒0.32蚯蚓還含有各種維生素、礦物質(zhì)元素、蚯蚓素、6-羥基嘌呤、琥珀酸、膽堿、蚯蚓解熱素、活性酶及某些抗菌肽。6.4結(jié)論1.蚯蚓營養(yǎng)肽含有豐富的氨基酸和多肽蚯蚓消化道內(nèi)具有多種消化酶,且活性較強,但至今沒有很好開發(fā)利用。已有報道指出,蚯蚓消化道中有10多種蛋白水解酶如蚯蚓纖溶酶等,這些蛋白酶類對蛋白質(zhì)有較強的水解活性,可使蛋白質(zhì)發(fā)生水解作用,已有研究發(fā)現(xiàn),機體對二、三肽的吸收比自由氨基酸的吸收快,并且能被肌肉組織及細胞直接利用。我們就是利用這一特性把蚯蚓體蛋白水解成可溶性的小分子活性肽和氨基酸,這些氨基酸和活性肽,可以直接被其它動物體完整地吸收,發(fā)揮其促生長及抗病的作用。2.蚯蚓營養(yǎng)肽中礦物質(zhì)元素和維生素的含量蚯蚓營養(yǎng)肽的礦物元素和維生素含量豐富尤其是鐵及維生素C、B1、B2的含量很高。從表12中可以看出,鉀、鐵、鈣、鈉、鋅等含量較為豐富,分別992,340,320,315和7.1毫克/毫升,并且含有一定數(shù)量的硒、錳等機體必需的微量元素,分別為0.32和3.87毫克毫升,。從表中可以看出,蚯蚓營養(yǎng)肽中維生素的含量非常豐富,其中,維生素B1為53.95毫克/升,維生素B2為84.02毫克/升,維生素C為382.9毫克/升,維生素E為30.98毫克/升,這些豐富的維生素對作為添加劑是非常有益的。因此,蚯蚓營養(yǎng)肽作為一種新型的飼料添加劑用于動物生產(chǎn)上是可行的。6.5蚯蚓營養(yǎng)肽對蛋雞的增產(chǎn)效果衡水市某蛋雞場存欄蛋雞1200只,分為2組,600只喂給蚯蚓營養(yǎng)肽,500只喂給清水作為對照。由靈壽縣肉牛養(yǎng)殖協(xié)會把活體蚯蚓溶化成液體,把液體蚯蚓兌入蛋雞飲水中(蚯蚓營養(yǎng)肽1∶飲水10),讓蛋雞自由飲用。用時投喂全價飼料。14d后,蛋雞產(chǎn)蛋由平均每8.2枚500g增重為每7.60枚500g。蛋黃顏色改變也十分明顯,由淡黃色變?yōu)榻鸺t色,煮熟食用口感由松軟變得柔韌。飼喂液體蚯蚓,消除了蛋雞對活體蚯蚓的恐懼感;又由于雞群飲水量均衡,蚯蚓營養(yǎng)肽蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、抗菌肽等營養(yǎng)元素含量豐富,攝入量一致,故雞產(chǎn)蛋量增加顯著,蛋黃變得深紅。提高了雞蛋品質(zhì),售價有所提高。七、市場預(yù)測由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對分子量較小、熱穩(wěn)定、水溶性好等優(yōu)點，更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒有作用，僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，在當(dāng)前不少病原菌對原有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性時。應(yīng)用無毒無公害的新型抗菌劑代替抗生素作飼料添加劑，已成為當(dāng)前國內(nèi)外飼料學(xué)科的一項重要內(nèi)容。 隨著人們對無污染綠色畜產(chǎn)品的渴望，開發(fā)生產(chǎn)綠色飼料添加劑已經(jīng)成為商家，市場競爭的新制高點。目前75%的飼料添加劑品種不符合綠色食品生產(chǎn)的需求，因此新型綠色飼料添加劑的市場前景是極其廣闊的，其經(jīng)濟效益是巨大的。據(jù)飼料工業(yè)協(xié)會統(tǒng)計，未來幾年綠色飼料添加劑的市場需求量迅速增加，每年可達15萬噸，按氨基酸酶肽制劑占總量的1/4計算，氨基酸酶肽制劑年需求量為近4萬噸，全國5年內(nèi)需求量估計在20-25萬噸。氨基酸酶肽制劑的平均價格為2萬元/噸，市場規(guī)模在40-50億人民幣左右。而應(yīng)用本技術(shù)成果投產(chǎn)年產(chǎn)抗菌肽飼料添加劑100噸的加工車間或加工廠，年產(chǎn)值可達200萬元?；贑8051F單片機直流電動機反饋控制系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機的嵌入式Web服務(wù)器的研究MOTOROLA單片機MC68HC（8）05PV8/A內(nèi)嵌EEPROM的工藝和制程方法及對良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機的通用控制模塊的研究基于單片機實現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調(diào)節(jié)器單片機控制的二級倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強型51系列單片機的TCP/IP協(xié)議棧的實現(xiàn)基于單片機的蓄電池自動監(jiān)測系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機系統(tǒng)的圖像采集與處理技術(shù)的研究基于單片機的作物營養(yǎng)診斷專家系統(tǒng)的研究基于單片機的交流伺服電機運動控制系統(tǒng)研究與開發(fā)基于單片機的泵管內(nèi)壁硬度測試儀的研制基于單片機的自動找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機的嵌入式系統(tǒng)開發(fā)基于單片機的液壓動力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測儀開發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機實現(xiàn)一種基于單片機的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機的噴油泵試驗臺控制器的研制基于單片機的軟起動器的研究和設(shè)計基于單片機控制的高速快走絲電火花線切割機床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機的機電產(chǎn)品控制系統(tǒng)開發(fā)基于PIC單片機的智能手機充電器基于單片機的實時內(nèi)核設(shè)計及其應(yīng)用研究基于單片機的遠程抄表系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機的煙氣二氧化硫濃度檢測儀的研制基于微型光譜儀的單片機系統(tǒng)單片機系統(tǒng)軟件構(gòu)件開發(fā)的技術(shù)研究基于單片機的液體點滴速度自動檢測儀的研制基于單片機系統(tǒng)的多功能溫度測量儀的研制基于PIC單片機的電能采集終端的設(shè)計和應(yīng)用基于單片機的光纖光柵解調(diào)儀的研制氣壓式線性摩擦焊機單片機控制系統(tǒng)的研制基于單片機的數(shù)字磁通門傳感器基于單片機的旋轉(zhuǎn)變壓器-數(shù)字轉(zhuǎn)換器的研究基于單片機的光纖Bragg光柵解調(diào)系統(tǒng)的研究單片機控制的便攜式多功能乳腺治療儀的研制基于C8051F020單片機的多生理信號檢測儀基于單片機的電機運動控制系統(tǒng)設(shè)計Pico專用單片機核的可測性設(shè)計研究基于MCS-51單片機的熱量計基于雙單片機的智能遙測微型氣象站MCS-51單片機構(gòu)建機器人的實踐研究基于單片機的輪軌力檢測基于單片機的GPS定位儀的研究與實現(xiàn)基于單片機的電液伺服控制系統(tǒng)用于單片機系統(tǒng)的MMC卡文件系統(tǒng)研制基于單片機的時控和計數(shù)系統(tǒng)性能優(yōu)化的研究基于單片機和CPLD的粗光柵位移測量系統(tǒng)研究單片機控制的后備式方波UPS提升高職學(xué)生單片機應(yīng)用能力的探究基于單片機控制的自動低頻減載裝置研究基于單片機控制的水下焊接電源的研究基于單片機的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于uPSD3234單片機的氚表面污染測量儀的研制基于單片機的紅外測油儀的研究96系列單片機仿真器研究與設(shè)計基于單片機的單晶金剛石刀具刃磨設(shè)備的數(shù)控改造基于單片機的溫度智能控制系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)基于MSP430單片機的電梯門機控制器的研制基于單片機的氣體測漏儀的研究基于三菱M16C/6N系列單片機的CAN/USB協(xié)議轉(zhuǎn)換器基于單片機和DSP的變壓器油色譜在線監(jiān)測技術(shù)研究基于單片機的膛壁溫度報警系統(tǒng)設(shè)計基于AVR單片機的低壓無功補償控制器的設(shè)計基于單片機船舶電力推進電機監(jiān)測系統(tǒng)基于單片機網(wǎng)絡(luò)的振動信號的采集系統(tǒng)基于單片機的大容量數(shù)據(jù)存儲技術(shù)的應(yīng)用研究基于單片機的疊圖機研究與教學(xué)方法實踐基于單片機嵌入式Web服務(wù)器技術(shù)的研究及實現(xiàn)基于AT89S52單片機的通用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于單片機的多道脈沖幅度分析儀研究機器人旋轉(zhuǎn)電弧傳感角焊縫跟蹤單片機控制系統(tǒng)基于單片機的控制系統(tǒng)在PLC虛擬教學(xué)實驗中的應(yīng)用研究基于單片機系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)通信研究與應(yīng)用基于PIC16F877單片機的莫爾斯碼自動譯碼系統(tǒng)設(shè)計與研究基于單片機的模糊控制器在工業(yè)電阻爐上的應(yīng)用研究基于雙單片機沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究與開發(fā)基于Cygnal單片機的μC/OS-Ⅱ的研究基于單片機的一體化智能差示掃描量熱儀系統(tǒng)研究基于TCP/IP協(xié)議的單片機與Internet互聯(lián)的研究與實現(xiàn)變頻調(diào)速液壓電梯單片機控制器的研究基于單片機γ-免疫計數(shù)器自動換樣功能的研究與實現(xiàn)基于單片機的倒立擺控制系統(tǒng)設(shè)計與實現(xiàn)單片機嵌入式以太網(wǎng)防盜報警系統(tǒng)基于51單片機的嵌入式Internet系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)單片機監(jiān)測系統(tǒng)在擠壓機上的應(yīng)用MSP430單片機在智能