基因工程第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第1頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月常見的基因工程工具酶及其應(yīng)用1.使核酸降解的核酸酶類：2.催化核酸合成的酶類：

3.核酸修飾酶類；

核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶甲基化酶、激酶、基團轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶等第2頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第4頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制/修飾系統(tǒng)

(R-M,Restriction-modificationsystem)B和K分別代表大腸桿菌的B和K菌株（引自Streips等,2002）第5頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月一、寄主控制的限制與修飾機理

修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾,從而免遭自身限制性酶的破壞。

第6頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月一、寄主控制的限制與修飾的機理限制(restriction)：指一定類型的細菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。

第7頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月限制/修飾系統(tǒng)

(R-M，Restriction-modificationsystem)第8頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶，以此來限制外源DNA的入侵幾乎所有的限制性內(nèi)切核酸酶都和能識別、甲基化相同DNA位點的甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）共同作用，一起構(gòu)成限制-修飾系統(tǒng)。

第9頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

寄主控制的限制與修飾的作用:

一是保護自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解。

基因工程中，應(yīng)采用

缺少限制作用的菌株作為受體。K12：

rk+mk+

rk-mk-（用于轉(zhuǎn)化實驗）

rk-mk+（用于轉(zhuǎn)化實驗）

rk+mk-（自殺型表型）第10頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化酶：甲基轉(zhuǎn)移酶①Dam甲基化酶

GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶

CCAGG或CCTGG第二個C上C5位置上引入甲基第11頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制性內(nèi)切核酸酶：在細胞內(nèi)能夠識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對DNA分子進行切割的一種酶以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5’端為磷酸基，3’端為羥基。1978年，W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎。第12頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月特性I型II型III型限制和修飾活性雙功能酶內(nèi)切核酸酶和甲基轉(zhuǎn)移酶分開雙功能酶酶蛋白分子組成3種不同亞基單一亞基兩種不同亞基限制作用所需輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸特異性識別位點非對稱序列回文對稱結(jié)構(gòu)非對稱序列切割位點在距識別位點至1kb處隨機切割識別位點上距識別位點24～26bp處序列特異性切割否是是甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化序列并切割能能能分子克隆中應(yīng)用無廣泛很少二、限制性內(nèi)切核酸酶的類型據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型三類。基因工程中廣泛使用第13頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

普遍采用的是Smith和Nathans（1973）提議的命名系統(tǒng)由屬名的第一個字母（大寫）和種名的前兩個字母（小寫），組成3個字母的略語組成酶的基本名稱。例如，大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。三、限制性內(nèi)切核酸酶的命名第14頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月若該微生物有不同的變種或品系，再加上該變種或品系的第一個字母。如EcoRI，HindI；如果某一種寄主菌株，具有幾個不同的限制－修飾體系，則以羅馬數(shù)字表示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的幾個限制與修飾體系分別表示為HindI、HindII、HindIII。注意所有字母、數(shù)字不再使用斜體，字母與羅馬數(shù)字之間不需要再留空格。所有的限制性酶，除了以上規(guī)定外，前面還應(yīng)帶有系統(tǒng)的名稱如限制性內(nèi)切核酸酶R.HindIII。同樣地，修飾酶則應(yīng)在它的系統(tǒng)名稱之前加上甲基轉(zhuǎn)移酶（M）名稱，如甲基轉(zhuǎn)移酶M.HindIII。在上下文已經(jīng)十分清楚且只涉及REase的情況下，R可被省去第15頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號

若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。第16頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月Escherichiacoli

RI—Haemophilus

influensaedⅢ—Streptomyces

achromagenesI

（Ⅱ)—EcoRIHindⅢSacI(II)REBASE數(shù)據(jù)庫（http：///)：識別序列、甲基化敏感性、商業(yè)信息和參考文獻等，數(shù)據(jù)庫每日都在更新。第17頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月四、II型限制核酸內(nèi)切酶的基本特性II型限制性核酸內(nèi)切酶只有一種多肽，以同源二聚體的形式存在。由于其識別和切割DNA分子序列具有嚴格的特異性，因而是基因工程中廣泛使用的工具酶它們被譽為基因克隆的“分子剪刀”

(molecularscissors)。識別序列的特異性1切割位點的特異性2第18頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）識別序列的特異性大多數(shù)II型限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列長度為4～6bp，具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)的回文序列如EcoRI的識別序列是：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-3’第19頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

稀有限制酶：

NotIGCGGCCGC

不嚴格專一限制酶：HindII-GTYRAC，

（Y表示C或T，R表示A或G）

識別序列越長，位點出現(xiàn)的概率越?。海?/4）n

但實際上未必所有的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列的出現(xiàn)概率都符合這樣的規(guī)律。第20頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

具有6堿基識別序列的不同REase產(chǎn)生的片段，其平均大小可能與預(yù)計值4096bp會有很大差異（表2-4）第21頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）切割位點的特異性

1.DNA分子酶切片段的末端依所用REase的不同，酶切后產(chǎn)生的片段末端，有黏性末端和平末端等形式。第22頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）黏性末端（stickyend）黏性末端是指DNA分子在REase的作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸形成的末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新連接起來。

圖2-2EcoRI產(chǎn)生的黏性末端及與其他來源互補黏性末端的退火連接

第23頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制性內(nèi)切核酸酶在識別序列的雙側(cè)進行切割，會產(chǎn)生兩種形式的黏性末端：①若于對稱軸的5‘末端切割，可產(chǎn)生5’端突出的黏性末端，如EcoRI；②若于對稱軸的3‘端切割，則產(chǎn)生3’端突出的黏性末端，如PstI（圖2-3）。

5’黏性末端3’黏性末端第24頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）平末端（bluntend）。若REase限制性酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的片斷末端為平末端，如SmaI（圖2-3）。平末端第25頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月5’突出的黏性末端第26頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月3’突出的黏性末端第27頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

平頭末端第28頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月黏性末端的意義①連接便利

i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。第29頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。

第30頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標(biāo)記凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。

③補平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。第31頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月2.同裂酶與同尾酶：SstICCGCGGSacICCGCGG新裂酶

KpnIGGTACCAsp718GGTACC

可應(yīng)用有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同，進行同樣的切割，但可能產(chǎn)生不同的末端。

同裂酶:能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶KpnIGGTACCAsp718GGTACC第32頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

Sau3AIBamHIGATC GGATCCCTAG CCTAGGSauI XhoI

GTCGAC CTCGAG

CAGCTG GAGCTCTCGA

?AGCTCGGC同尾酶（isocaudamer）：來源各異，識別的靶序列也各不相同，但切割后能產(chǎn)生相同的黏性末端，稱為同尾酶。第33頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大(相容性末端);同時，同尾酶產(chǎn)生的DNA片段能通過粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來，這在分子克隆中有一定的作用;雜種位點（hybridsite）：由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結(jié)合形成的位點。一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。同尾酶可便于克隆載體的改造和構(gòu)建，且可用于消除某些限制酶切點，但如果要回收重組克隆中的插入片段時，則要慎重選擇適當(dāng)?shù)耐裁浮５?4頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

五、影響限制性內(nèi)切核酸酶活性的因素DNA分子的構(gòu)型酶的星號活性反應(yīng)緩沖液DNA樣品的純度2酶切反應(yīng)的溫度4酶的純度31DNA的甲基化程度335736第35頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）酶的純度高質(zhì)量的限制性內(nèi)切核酸酶應(yīng)是通過全面提純的，不存在其他內(nèi)切核酸酶或外切酶的污染在長時間酶解時不出現(xiàn)識別序列特異性的下降酶解的DNA片段連接后能重新被識別和切割等。

第36頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）DNA樣品的純度在采用不同的方法制備DNA樣品過程中，會使樣品含有殘留氯仿、苯酚、乙醇、EDTA、SDS、鹽離子等物質(zhì)，或未去除干凈的蛋白質(zhì)或多糖的殘留物，這些物質(zhì)都可能影響REase的酶切反應(yīng)活性。第37頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月條件受到限制，且必須在DNA純度不高的情況下進行切割，可考慮采取以下措施提高酶活性適當(dāng)增加酶的用量擴大反應(yīng)體系體積延長反應(yīng)時間添加陽離子亞精胺第38頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）DNA的甲基化程度原核生物細胞內(nèi)存在限制-修飾系統(tǒng)，其中MTase甲基轉(zhuǎn)移酶對DNA起修飾作用，從而使自身DNA不受體內(nèi)限制性內(nèi)切核酸酶的切割甲基化作用直接影響限制性內(nèi)切核酸酶的活性為了克服MTase甲基轉(zhuǎn)移酶的影響，在基因克隆中使用MTase缺失的菌株來制備質(zhì)粒DNA。第39頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）酶切反應(yīng)的溫度消化DNA分子時，不同的REase具有不同的最適反應(yīng)溫度。對于大多數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶，最適反應(yīng)溫度為37℃，但也有例外。例如，SmaI、ApaI、BclI、MaeIII、TaqI的最適反應(yīng)溫度分別是25℃、30℃、50℃、是55℃、65℃。酶切反應(yīng)時低于或高于最適溫度，都會影響酶的活性，甚至使酶失活。第40頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）DNA分子的構(gòu)型底物DNA分子的構(gòu)型會對限制性內(nèi)切核酸酶的活性產(chǎn)生明顯影響。例如，對超螺旋質(zhì)粒DNA或病毒DNA分子酶切時，所需要的酶量比對線性DNA分子酶切時所需要的酶量要高許多。第41頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月超螺旋質(zhì)粒DNA分子線性DNA分子第42頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

（六）反應(yīng)緩沖液限制性內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)緩沖液中包含有以下幾種成分：氯化鎂或醋酸鎂、氯化鈉或醋酸鉀、二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇、Tris·HCl或Tris·HAc。多數(shù)酶切反應(yīng)所需pH7.0～7.6。緩沖液中β-巰基乙醇或DTT可防止酶的氧化。市售酶中都配有10倍的濃縮緩沖液，使用時只需加反應(yīng)體系的1/10即可。

第43頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（七）酶的星號活性（staractivity）定義：限制性內(nèi)切核酸酶識別和切割特異性位點是在特定的條件下測定的。當(dāng)條件改變時，許多酶的識別位點會改變，導(dǎo)致識別與切割序列的非特異性，這種現(xiàn)象稱為星號活性。導(dǎo)致星號活性的原因主要有：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等第44頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月六、限制性內(nèi)切酶對DNA的不同消化作用的應(yīng)用DNA分子的雙酶切消化

1DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化2第45頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）DNA分子的雙酶切消化定義：在分子克隆實驗中，有時需要雙酶切法，即用兩種不同的REase切割同一種DNA分子，從而產(chǎn)生DNA分子片段帶有兩個不同的末端。如果載體分子也用同樣的兩種酶切，這樣就可以把外源DNA酶切片段定向地插入到載體分子中。第46頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化完全酶切消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。部分酶切消化：內(nèi)切酶在DNA上的所有位點只有部分被切開。在實驗中，通常通過縮短酶切消化的反應(yīng)時間或降低反應(yīng)溫度以約束酶的活性以達到部分消化的目的。第47頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子的完全酶切消化（a）和部分酶切消化（b）第48頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月七、限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用：重組前DNA的切割構(gòu)建新載體構(gòu)建物理圖譜第49頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

第二節(jié)DNA連接酶第50頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

第二節(jié)DNA連接酶剪刀-限制性內(nèi)切酶針線、膠水-連接酶第51頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月概念：DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的。它是一種能夠催化雙鏈DNA上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。該過程為吸能反應(yīng)過程。連接反應(yīng)的特點：①一條DNA鏈的3’末端具有游離的羥基（-OH），而另一條DNA鏈的5’末端具有游離的磷酸基團（-P）；②連接需要ATP或NAD+和Mg2+為輔助因子和激活因子；③被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分；④DNA連接酶只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)。一、DNA連接酶（DNAligase）

第二節(jié)DNA連接酶第52頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA連接酶對不同DNA分子的連接作用第53頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)缺口（nick）：雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。裂口（gap）：雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的單鏈斷裂。第54頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第55頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月類型：T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶和熱穩(wěn)定DNA連接酶。大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源第56頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）T4噬菌體DNA連接酶（應(yīng)用最廣泛的連接酶）T4DNA連接酶可連接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平末端的連接，是基因工程中廣泛使用的連接酶高濃度（＞100mmol／L）單價陽離子，如Na+和K+，可對T4DNA連接酶的活性產(chǎn)生抑制。而聚合劑可增強連接酶活性。（二）大腸桿菌DNA連接酶連接具粘性末端DNA分子，對平末端及DNA-RNA之間的連接效率低下，在分子克隆實驗中不常用。（三）熱穩(wěn)定DNA連接酶優(yōu)先作用于雙鏈的缺口，可在多次的熱循環(huán)后依然保持活性，因此被廣泛用于檢測哺乳類DNA突變的擴增反應(yīng)中。

二、DNA連接酶的特性第57頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

連接酶底物輔助因子和激活因子溫度巰基試劑黏性末端平末端DNA-RNA雜合體RNA-RNA雜合體E.coliDNA連接酶可行可行不行不行NAD+

Mg2+（1～3mmol/L）黏性末端:10～15℃補平缺口：37℃不需要T4DNA連接酶可行可行可行可行ATPMg2+（10mmol/L）黏性末端：4℃平末端：10～25℃補平缺口：37℃需DTT噬熱菌連接酶可行不行不行不行NAD+

Mg2+（10mmol/L）黏性末端：24～37℃補平缺口：65～72℃需要表2-5DNA連接酶的部分性質(zhì)第58頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月三、DNA連接酶的連接機理

DNA連接酶是利用ATP

或NAD+提供的能量催化

DNA雙鏈間的缺口形成磷酸二酯鍵，連接反應(yīng)的機理已被詳細研究（圖2-5）。

圖2-5T4DNA連接酶作用機理第59頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月四、影響連接反應(yīng)的因素10×T4DNALigaseBuffer 1μlpKRX-T（30ng/μl）1μl已純化的PCR產(chǎn)物 Xμl*T4DNALigase2~3WeissUnitsddH2O 至10μlDNA連接酶的反應(yīng)體系16℃連接過夜第60頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月在進行DNA分子重組操作中，有許多因素會影響到DNA片段的連接，包括：連接反應(yīng)的溫度連接酶濃度反應(yīng)時間DNA的末端結(jié)構(gòu)及不同DNA片段末端的相對濃度ATP濃度離子濃度等

第61頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月1.反應(yīng)溫度溫度是影響連接反應(yīng)連接效率的主要因素。連接酶的最佳反應(yīng)溫度是37℃，但是在這個溫度下，黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。與黏性末端的連接反應(yīng)相比，平末端連接反應(yīng)受溫度的影響較小。第62頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月2.連接酶濃度在同樣的條件下，具黏性末端DNA片段間的連接比平末端DNA分子的連接所需酶濃度低。3.ATP濃度

T4噬菌體DNA連接酶需要ATP作為連接反應(yīng)的輔助因子，其濃度對酶的影響很大。其反應(yīng)終濃度變化范圍在10μmol～1mmol/L之間，一般情況下ATP最適的終濃度為0.5mmol/L。第63頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月4.DNA片段末端由于連接反應(yīng)涉及不同DNA分子（分子間連接），因此連接反應(yīng)對DNA分子的末端濃度會十分敏感。在反應(yīng)體系中，有載體分子和要插入載體的DNA片段，由于DNA末端之間的相互競爭，可形成不同構(gòu)型的DNA分子（圖2-6），所以不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA末端的總濃度，而且還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。第64頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月圖2-6分子間的不同連接產(chǎn)物

第65頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月回顧上節(jié)課內(nèi)容1、限制-修飾系統(tǒng)：缺陷型工程菌的選擇2、II型限制酶的基本特性:3、平末端與粘性末端：4、同尾酶與同切點酶:5、應(yīng)用：單酶切與雙酶切；完全消化與不完全消化6、T4連接酶的連接特點第66頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第67頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第68頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（DNApolymerase)指能在引物和模板的存在下，將脫氧核糖單核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。類型：①依賴于DNA的DNA聚合酶，如耐熱的TaqDNA聚合酶；②依賴于RNA的DNA聚合酶——反轉(zhuǎn)錄酶。第69頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

表2-6DNA聚合酶的部分性質(zhì)DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶I低有中低Klenow片段低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高反轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高第70頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）大腸桿菌DNA聚合酶I

從大腸桿菌中分離純化得到3種類型的DNA聚合酶，DNApolI、DNApolyII、DNApolyIII，其中DNApolyI在分子克隆中最為常用。

DNApolyI具有3種活性：①5‘→3’DNA聚合酶活性；②3‘→5’外切酶活性；③5’→3’外切酶活性（圖2-7）。也稱為DNA聚合酶I全酶。一、DNA聚合酶第71頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月A.5'→3'聚合酶活性；B.5'→3'外切酶活性；C.3'→5'外切酶活性圖2-7大腸桿菌DNA聚合酶I活性

第72頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

用途：

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時）

2）補齊5’-突起端

3）合成第二條cDNA4）切口移位制備探針

其中用途2)和3)常用Klenow大片段第73頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月切口平移（nicktranslation）制備探針：第74頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）Klenow片段

大腸桿菌DNApoll經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow片段。

Klenow片段仍擁有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。第75頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月分子克隆中Klenow片段的主要用途有：①補平經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA所形成的3’凹陷末端，包括帶裂口的雙鏈DNA的修復(fù)；5’

klenowklenow5’

②用32PdNTP對帶3'凹陷末端補平，標(biāo)記DNA分子3'末端；第76頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月③在cDNA克隆中，用于cDNA第二鏈的合成；mRNA5’5’5’3’3’3’逆轉(zhuǎn)錄klenow引物cDNA第一鏈cDNA第二鏈第77頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月④用于Sanger雙脫氧末端終止法進行DNA序列分析；⑤在單鏈模板上延伸寡核苷酸引物，以合成雜交探針和進行體外突變。第78頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）T4噬菌體DNA聚合酶

T4噬菌體DNA聚合酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，相對分子質(zhì)量為114000，由單一肽鏈組成。與Klenow片段相似，T4噬菌體DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，缺少5'→3'外切酶活性。但其3'→5'外切酶活性比Klenow片段要高200倍。第79頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月T4噬菌體DNA聚合酶的主要作用有：①用于補平或標(biāo)記DNA分子經(jīng)REase消化后產(chǎn)生的3‘凹端；②對帶有3‘突出末端或平末端的DNA片段進行標(biāo)記，制備特異性探針；③利用T4噬菌體DNA聚合酶強的3'→5'外切酶活性，將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化為平末端。第80頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第81頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）T7噬菌體DNA聚合酶

T7噬菌體DNA聚合酶是所有已知DNA聚合酶中持續(xù)結(jié)合能力最強的一個，所催化合成的DNA平均長度要比其他DNA聚合酶催化合成的DNA平均長度大得多，在分子克隆實驗中主要用于催化大分子模板。

T7噬菌體DNA聚合酶具有很強的3‘→5’外切酶活性，其外切活性約為大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的1000倍。在分子克隆中，第82頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，Saiki等于1988年將該酶成功地用于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），從而極大地促進了DNA的離體擴增技術(shù)的飛速發(fā)展。TaqDNA聚合酶除具有5‘→3’聚合酶活性外，還有5‘→3’外切酶活性，但沒有3‘→5’外切活性，因而無3‘→5’方向的校正功能。普通TaqDNA聚合酶在聚合鏈末端不依賴模板多聚合出一個腺苷酸，人們根據(jù)這種性質(zhì)，設(shè)計出了一種線型克隆載體—T載體，其5'末端有一個突出的T，正好與PCR產(chǎn)物3'端突出的A互補，這樣就可方便地將PCR產(chǎn)物直接連接到載體上。

第83頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月是以RNA為模板，催化合成互補的DNA（complementaryDNA，cDNA）單鏈。普遍存在于含RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒中。目前市售的反轉(zhuǎn)錄酶主要有2個來源：作用①禽源的，來源于禽類成髓細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus，AMV），42℃；②鼠源的，來源于Moloney鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus，Mo-MLV），37℃。二、反轉(zhuǎn)錄酶第84頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月在分子克隆中反轉(zhuǎn)錄酶主要作用于：①以mRNA為模板合成其互補DNA（cDNA），用于構(gòu)建cDNA文庫和基因克??；②對具5’端突出的DNA片段的3’進行補平和標(biāo)記，制備雜交探針；③代替大腸桿菌DNApolI、Klenow片段或測序酶，用于DNA序列分析。第85頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月④RNA酶H活性：對RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用NaOH降解RNA模板。RNaseH活性第86頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)DNA修飾酶第87頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月簡稱末端轉(zhuǎn)移酶，可以在無模板的條件下，非特異地將脫氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH末端，伴隨無機磷酸的釋放。末端轉(zhuǎn)移酶主要用途有：1）按照模板合成多聚核糖核苷同聚物(同聚物加尾);2）用于克隆DNA片段到目的載體中;3）用于DNA片段3’末端標(biāo)記。一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾第88頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月末端轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾功能圖解第89頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’-OH末端，使已脫磷酸化的5’末端重新磷酸化。這種作用不受底物分子鏈的長短的限制，即使單核苷酸也同樣適用。該酶常用于兩種反應(yīng)：正向反應(yīng)和交換反應(yīng)。（1）正向反應(yīng)：即催化5‘-OH末端的磷酸化，這是T4多核苷酸激酶的最主要功能。（2）交換反應(yīng)：當(dāng)過量ADP存在時，DNA分子的5‘磷酸轉(zhuǎn)移給ADP，然后脫磷酸化的DNA分子再從帶有γ-32P的ATP中獲得γ-32P基團，重新磷酸化DNA分子就獲得了32P同位素標(biāo)記。二、T4多核苷酸激酶與DNA5’端磷酸化第90頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

圖2-9T4多核苷酸激酶的正向反應(yīng)活性（A）和交換反應(yīng)活性（B）﹡代表放射性同位素標(biāo)記第91頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月堿性磷酸酶能夠催化核酸分子脫掉5‘的磷酸基團，從而使DNA（或RNA）片段的5’－P末端轉(zhuǎn)換成5‘－OH末端。堿性磷酸酶有兩種來源：一種來源于大腸桿菌，叫做細菌堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，BAP）；另一種來源于小牛腸，叫做小牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。三、堿性磷酸酶與DNA5’端去磷酸化第92頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月堿性磷酸酶在基因工程中的用途主要有以下兩個方面：（1）DNA分子片段5‘末端的去磷酸化，防止自身連接。（2）在5‘末端標(biāo)記之前，去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基團。第93頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

圖2-10載體分子的去磷酸化與外源DNA的連接（引自Weaver，2002）其中每條鏈上都有一個nick，但轉(zhuǎn)入細菌后會被修復(fù)。第94頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)外切核酸酶（自學(xué)）核酸外切酶是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。作用于單鏈的核酸外切酶

如：大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）；大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）作用于雙鏈的核酸外切酶

如：大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）；噬菌體核酸外切酶（

exo）；T7噬菌體基因6核酸外切酶既可作用于單鏈又可作用于雙鏈的核酸外切酶

如：Bal31核酸酶第95頁，課件共108頁，創(chuàng)作于2023年2月

第六節(jié)單鏈核酸內(nèi)切酶Bal31核酸酶S1核酸