實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移

李曉華程國(guó)軍一：目的要求了解在自然條件下微生物遺傳信息傳遞的方式；掌握細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的原理和流程。

二：基本原理在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移過(guò)程中，供體菌與受體菌細(xì)胞通過(guò)結(jié)合作用緊密接觸，質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體轉(zhuǎn)移，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制，這就是結(jié)合轉(zhuǎn)移的過(guò)程。按能否自主轉(zhuǎn)移，將天然存在的質(zhì)粒分為兩大類。

1．轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒：多為低拷貝的大質(zhì)粒，含有完整的轉(zhuǎn)移操縱子基因（tra）和轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)。能在同種或親緣關(guān)系近的菌體細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。例如：

大腸桿菌：F因子、R1、R100、R6K、RP4……天藍(lán)色鏈霉菌：致育性因子pSCP1、pSCP2……2．非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒：多為高拷貝的小質(zhì)粒，如大腸桿菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少轉(zhuǎn)移基因（tra），不能自主轉(zhuǎn)移，但由于含有與F質(zhì)粒類似的bom（或nic）位點(diǎn)或誘動(dòng)基因mob（mobilization），因而能被帶有tra基因的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒誘動(dòng)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。三：實(shí)驗(yàn)菌株供體菌：E.coliDH5α(pTR102)(TcR)，含有mob基因

；受體菌:紫云英根瘤菌(TcS)

；輔助菌:E.coliMM294(pPK2073)（SpeR），含有tra基因。

四：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

準(zhǔn)備將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期：供體菌：E.coliDH5α(pTR102)(TcR)，LB+Tc20μg/ml，37℃震蕩培養(yǎng)1夜；受體菌:Sinorhizobiumfredii(TcS)，TY,28℃震蕩培養(yǎng)2天；輔助菌:E.coliMM294(pPK2073)（SpeR），LB+Spe50μg/ml37℃震蕩培養(yǎng)1夜用可調(diào)定量移液器吸取供體、輔助菌各0.4ml，吸受體菌0.6ml，都加入同一eppdorf管內(nèi)（每個(gè)同學(xué)做1管），放入離心機(jī)內(nèi)，10000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘。倒上清，向沉淀加1ml的TY液體，用tip上下抽吸，洗滌菌體，再10000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，倒上清，留100μl左右用于懸浮菌體。倒TY平板，然后用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準(zhǔn)備好的TY平板上（每2個(gè)同學(xué)1片，2-3片/平板）。用200μl的tip抽吸eppdorf管內(nèi)沉淀的菌體，打散成濃菌液，將之加到濾紙片中央（切勿傾斜平板，以免菌液流出濾紙片以外）,吹干。28℃培養(yǎng)2天。操作步驟（第一天）

倒SM平板將基本培養(yǎng)基（SM）溶化，加千分之一的維生素混合液，然后加相應(yīng)量的四環(huán)素（15U/ml），每2人1皿。另準(zhǔn)備1瓶基本培養(yǎng)基，不加抗生素，用于對(duì)照。將倒好的平板用報(bào)紙包好后放入4℃冰箱，備用。（注：四環(huán)素在強(qiáng)光下易分解）向滅菌青霉素瓶中加3ml無(wú)菌水，將已培養(yǎng)的TY平板上的濾紙片用無(wú)菌鑷子放入水中，在震蕩混勻器上洗菌體，充分打散。向1ml的ep管加0.9mL無(wú)菌水，取0.1ml菌液，混勻。

吸取200μL涂皿。少數(shù)同學(xué)另取稀釋液，涂1板不加Tc的SM做對(duì)照。平板放28℃培養(yǎng)4-6天后看結(jié)果。操作步驟（第三天）

五：實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容轉(zhuǎn)移頻率=SM+Tc平板的