實驗十三酶聯(lián)免疫分析第1頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月一、ELISA的發(fā)展歷程免疫酶標記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來的一新型血清學技術(shù)。1966年，Nakane和Avrameas等分別報道用酶代替熒光素標記抗體，建立了酶標抗體技術(shù)，用于生物組織中抗原的定位和鑒定。1971年，Engvall，VanWeemen等報道了酶聯(lián)免疫吸附試驗，從而建立了酶標抗體的定量檢測技術(shù)。第2頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月20世紀80年代，酶標記抗體檢測和鑒定蛋白質(zhì)分子的免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)問世。目前，免疫酶標記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測和分子生物學研究中應用最廣泛的免疫學方法之一。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay），簡稱ELISA。第3頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月二、ELISA的原理

抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合基礎:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留其酶的活性。第4頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測過程包被封閉受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應加入酶標記抗原或抗體加入酶反應的底物底物被酶催化成為有色產(chǎn)物進行定性或定量分析第5頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月三、ELISA的類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相抗原或抗體，即“免疫吸附劑”；（2）酶標記抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”；（3）酶反應的底物。可設計出各種不同類型的檢測方法。

第6頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月雙抗體夾心法示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。第7頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月雙抗原夾心法示意圖1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗原，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標記抗原復合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標記抗原抗體抗原固相載體第8頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月酶抗抗體酶標記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標記抗抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。間接法示意圖第9頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月捕捉法示意圖酶抗體酶標記抗體抗原抗抗體固相載體抗體1.將抗抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體復合物。3.加入抗原及酶標記抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。第10頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月酶標抗原競爭法示意圖固相載體抗體抗原酶酶標記抗原1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則優(yōu)先競爭結(jié)合抗體，結(jié)合為抗原抗體復合物。3.加入酶標記抗原，抗原沒有結(jié)合的位點，酶標記抗原去占據(jù)，則結(jié)合為酶標記抗原-抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。抗原第11頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月四、ELISA的試劑ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；2）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）；3）酶的底物；4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；5）結(jié)合物及標本的稀釋液；6）洗滌液；7）酶反應終止液第12頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫吸附劑——固相載體

聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。聚氯乙烯--聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。第13頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，依靠兩者的疏水基團之間的作用。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可以間接包被，采用捕獲包被法。脂類物質(zhì)，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，待溶劑揮發(fā)，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。包被方式

第15頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。第16頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月包被用抗體取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須純化后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。第17頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月包被的條件

緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2的磷酸鹽緩沖液

pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，需實驗選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。第18頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后續(xù)步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉。第19頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)合物即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑酶的催化活性抗體（或抗原）的免疫活性含有或少含有游離的抗體（或抗原）結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。第20頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)合物用的抗原和抗體

制備結(jié)合物時，抗原或抗體在與酶聯(lián)結(jié)時，避免有其他雜蛋白的干擾，最好用層析純化的抗體，使全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。第21頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月

酶純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在ELISA中，HRP，堿性磷酸酶AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。第22頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月底物HRP的底物DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等。第23頁，課件共25頁，創(chuàng)作于2023年2月鄰苯二胺(OPD)氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液。