禽流感病毒Avian

influenza

virusLecture

9一、禽流感（Avian

Influenza）概述由A型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）的感染和疾病綜合征。高致病性禽流感（Highly

PathogenicAvian

influenza,

HPAI）：OIE

list

A中國：一類動物疫病，4個重大動物疫病之一低致病性禽流感（MPAI、LPAI）禽流感人流感發(fā)生對象主要是雞、火雞人發(fā)生時間130多年（1878年，意大利）400多年病毒分離1956(鴨），1959年1933年流感病毒型AA、B、C病毒亞型野禽：H1-15、N1-9（潛在）高致病：H5和H7H1-3、N1、N2年份流感病毒死亡1918-1919“西班牙”Type

A

(H1N1)20

million

worldwide550,000

US1957-1958“亞洲”Type

A

(H2N2)70,000

US1968-1969“香港”Type

A

(H3N2)34,000

USGlezen

WP.Epidemiol

Rev.

1996;18:65.Centers

for

Disease

Control

and

Prevention.

Influenza

Prevention

and

Control.

Influenza.

Available

at:.二十世紀流感大流行禽流感的公共衛(wèi)生意義1996H7N7英國1（養(yǎng)鴨婦女）1997H5N1香港18（死亡6）1999H9N2香港2（女孩）1998-99H9N2廣州52003.2H5N1香港22003.2H7N7荷蘭83（死亡1）2004.1H5N1中國，泰國，越南等21人On

average,

approximately

20,000

Americans

diefrom

the

complications

of

influenza

each

year.SLAUGHTER

OF

THE

INNOCENTS:

In

December,

1997,Hong

Kong

officials

gassed

more

than

a

million

chickenssuspected

of

harboring

the

virusJohn

Stanmeyer--

SABA禽流感在中國大陸的發(fā)生1994年首次報道H9亞型AIV的分離1998年后H9亞型AIV在中國普遍發(fā)生1996年首次從鵝分離到H5N1亞型AIV2000-2003：多次發(fā)生H5亞型HPAI2004-

向世界公布H5N1

HPAI在中國發(fā)生其他病毒分離：H9N2（1994，廣東）；H4N6（1995，四川）；H14N5（1996，新疆）H5N1（1996，廣東，鵝）；H7N2（2002，河北）早期，從健康水禽分離到AIV(亞型？）Swine

in

mixed

herds

with

infected

poultry

are

at

risk

for introduction

of

the

avian

influenza,

subtype

H7N7.Swine

in

mixed

herds

with

no

infected

poultry

or

swine

in

herds

with

no

poultry

at

all

are

at

no

significant

risk

for

introduction

of

the avian

influenza,

subtype

H7N7.No

evidence

was

found

for

(ongoing)

transmission

between

pigs.Most

of

the

infections

seem

to

be

transmitted

from

poultry

to

swine,either

directly

or

indirectly.No

evidence

was

found

that

the

virus

is

able

to

remain

for

a

long period

in

the

swine

herds

after

the

removal

of

the

source

of infection,

namely

the

infected

poultry.It

seems

most

likely

that

no

residual

avian

influenza

virus

was present

in

any

of

the

swine

herds

tested.二、禽流感病毒的生物學特性nucleocapsid

(RNA

fragmentswrapped

in

protein)envelopehaemagglutinin

andneuraminidase

“spikes”In

envelope100

nm正粘病毒科A型流感病毒B型流感病毒C

型流感病毒人馬豬鳥海洋哺乳動物人人豬自然條件中的HA血清型分布HA

serotype鳥馬豬人HA1HA2yesyesyesyesyesHA3yesyesyesyesHA4yesHA5yesyesHA6yesHA7yesyesHA8-15yes馬yesyes豬yesyesN1N2N3N4N5N6N7N8N9鳥yesyesyesyesyesyesyesyesyes人yesyes自然條件中的NA血清型分布A型B型C型severity

of

illness+++++++animal

reservoiryesnonohuman

pandemicsyesnonohuman

epidemicsyesyesno

(sporadic)antigenic

changesshift,

driftdriftdriftsegmented

genomeyesyesyesamantadine,

rimantidinesensitiveno

effectno

effectzanamivirsensitivesensitivesurface

glycoproteins22(1)命名A/equine/Saskatoon/1/90(H3N8)groupspeciesyearIsolate

numberlocationSerotype

ofHA

and

N?A/equine/Prague/1/56(H7N7)?A/fowl/Hong

Kong/1/98(H5N1)?A/swine/Lincoln/1/86(H1N1)INFLUENZA

VIRUSES(Family

Orthomyxoviridae)8

segments

of

single

stranded,

negative

sense

RNA, helical

nucleocapsidsenveloped

virion,

with

2

types

of

peplomers

(spikes)=

H

(haemagglutinin)

and

N

(neuraminidase)ORTHOMYXOVIRUSESHA

-

hemagglutininNA

-

neuraminidasehelical

nucleocapsid

(RNA

PLUSNP

protein)lipid

bilayer

membranepolymerase(3

PROTEINS)M1

proteintype

A,

B,C

:

NP,

M1

proteinsub-types:

HA

or

NA

proteinHaemagglutinin

andNeuraminidasereceptorbindingsiteactive

sitevariableloopsvariableloopsHA

Nsialic

acidon

receptorCleavage

of

HAClara

(mucus),extracellular,serum,bacterialproteasesHA0HA1HA2bindsreceptorbindsreceptorpenetratescellHA

cleavage

and

virulenceMay

‘94

->June

‘94Dec

‘94

->Jan

‘95P

Q

-

-

R

E

T

RlowcleavabilityP

Q

R

K

R

K

T

RhighcleavabilityhighvirulencesystemicinfectonlowvirulencerespiratoryinfectionINFLUENZA

VIRUSES病毒在細胞核和細胞漿中復制雞胚培養(yǎng)流感病毒的復制HA

cleavedbyproteasesHA

binds

toreceptorvirus

inphagolysosomeloweredpH,HAfusesmembranesRNAreleasedvirusbudsN

releasesvirus流感病毒的結構特點基因組是分節(jié)段的單股負鏈RNA。A型和B型流感病毒基因組含8個節(jié)段，C型流感病毒基因組含7個節(jié)段（缺NA）。每個基因節(jié)段的5’端前13個核苷酸和3’端

12個核苷酸序列高度保守,5’端及3’端部分序列互補。3’-UCG(U/C)UUUCGUCCNNN5’-pppAGUAGAAACAAGGNNN流感病毒的結構特點至少編碼10種以上蛋白多肽。RNA1節(jié)段－PB2蛋白RNA2節(jié)段－PB1蛋白RNA3節(jié)段－PA蛋白RNA4節(jié)段－HA蛋白RNA5節(jié)段－NP蛋白RNA6節(jié)段－NA蛋白（B型病毒編碼NA蛋白和NB非結構蛋白，C型病毒無此節(jié)段）RNA7節(jié)段－M1和M2蛋白RNA8節(jié)段－NS1和NS2蛋白流感病毒的復制吸附、穿膜和脫殼病毒HA結合宿主細胞表面含唾液酸的受體→吞飲→pH值下降→膜融合→核衣殼進入胞漿病毒RNA的轉錄和復制初始轉錄（mRNA的合成）：病毒轉錄酶復合體（vRNP，包括PB2、PB1、PA、NP）；宿主mRNA的5’端帽狀結構；vRNA的不完全轉錄二級轉錄（vRNA的合成）：合成互補RNA（cRNA）；多種功能性的病毒蛋白參與；無需引物；能獲得全長

vRNAUCG(C/U)UUUCGUCCGGAACAAAGAUGAm7GpppXmY……(A/G)5’

Cap宿主mRNAPB2m7GpppXmY……(A/G)3’

NCRNCR

5’vRNAGC(G/A)AAAGCAGGAAAA5’3’mRNAA(+)cRNA15-22nt病毒mRNA進入細胞質(zhì)用于翻譯病毒蛋白UCG(C/U)UUUCGUCC3’

NCRNCR

5’GGAACAAAGAUGAvRNApppAGC(G/A)AAAGCAGG5’3’A(-)cRNACCUUGUUUCUACU轉錄出子代vRNA流感病毒的復制蛋白合成病毒mRNA進入細胞質(zhì)用于翻譯病毒蛋白感染初期主要產(chǎn)生NP和NS1病毒粒子的裝配病毒的出芽和釋放流感病毒的抗原變異*

流感病毒有高度的抗原變異性:抗原漂移(H+N

基因中的點的突變)H

or

N蛋白質(zhì)氨基酸序列的輕微的改變抗體可能部分識別新的抗原（結合性不強）雞群僅部分地得到保護

(過去的疫苗效果不佳）RNAHemagglutininNeuraminidaseAntibodiesSialic

acid抗原漂移抗原漂移U

C

G

A C

A

U

U

U

G

C

GMUTATIONU

C

G

A C

A

C

U

U

G

C

GTRANSCRIPTIONA

G

C

U G

U

G

A

A

C

G

CTRANSLATIONPROTEIN

FOLDINGSerCysGluArgImage

courtesy

of

Teach

America

Corporation流感病毒抗原變異抗原轉變或轉換(基因重排):RNA片段‘包裹’;(主要發(fā)生與鴨子)病毒成為新的亞型,如從H1N1

變成H1N2抗老的亞型病毒的抗體將不能識別新的亞型造成疾病的流行(群體沒有免疫力)如1918

年H3N8

變成H1N1

20

x

106

死亡(豬在感染了人和禽的流感病毒后，可能產(chǎn)生新的病毒，對人致?。┛乖D變抗原轉變新雜交病毒人流感病毒豬流感病毒+251

種可能的重排父母代亞型肺細胞病毒-RNA片段LUNGLPAI

vs.

HPAICritical

distinction!LPAI

=

mild

or

no

disease,

not

monHPAI

=

severe

disease,

rare

inUSCan

have

high

mortality

with

LPAIduetocomplicating

factors,

such

as

coliform

pneumoniaLPAI

can e

HPAIin

some

casesOccurs

only

with

H5

and

H7

types

of

influenzaResult

of

genetic

changes

in

Hemagglutiningenetic

sequenceLPAI

vs.

HPAILPAI

conversion

toHPAI

has

occurredseveraltimes

in

recent

pastPennsylvania,

1983Mexico,

1995Italy,

2001Pakistan,

ongoingMultiple

others,

undocumented

/

untested

in

numerouscountries

in

worldBecause

of

possible

conversion

of

H5

and

H7LPAI

to

HPAI,

special

attention

is

paid

to

thesetwo

Hemagglutinin

typesAvian

Influenza

transmissionCan

persist

in

affected

birds

and

flocks

formonthsTransmitted

by

most

meansEasilytransmitted

on

contaminated

clothing,shoes,equipment,cages,

etc.HPAI-clinical

signsClinical

signsDisease

in

most

species

of

birds--in

US,

most

inchickens

and

turkeysRepiratory

disease—snicking,

sneezing,lacrimation,

sinusitis,

etc.High

mortalityNeurologic

disease

(in

some

cases)May

be

sudden

mortality

without

significantclinical

signsChange

in

eggshell

pigmentation,

shell-lesseggs

producedHPAI-Gross

LesionsCyanosis

of

face,

comb,

wattlesSubcutaneous

hemorrhage

of

shanksPeriorbital

/

facial

edemaVesicles

on

comb

/wattlesSinusitis

/

nasal

dischargeCaseous

to

hemorrhagic

tracheitisHemorrhage

at

ventricular

/

proventricularjunctionVascular

damage

/

edema

&

hemorrhage

atnumerous

sitesOIE

判定高致病性禽流感的關鍵點（IVPI）The

OIE

criteria

for

classifying

an

avian

influenzavirus

as

highly

pathogenic

using

the

IVPI

test

is:1：10稀釋的感染性尿囊液，靜脈注射4-8周齡的易感雞，每羽0.2ml，10天內(nèi)致死6-8羽，這樣的流感病毒為高致病性禽流感病毒。Examples

of

IVPI

indicesHighly

pathogenic2.0-3.0

(range

1.74-3.0)Non

pathogenic0

(range

0-1.0)Intermediate

1.2-1.4**

Exceptionally

viruses

of

H10

subtype

have

given

IVPI’smarginally

in

excess

of

1.2

and

would,

according

to

theEuropean

Union

definition,

be

classified

as

highlypathogenic

irrespective

of

the

amino

acid

motif

at

thecleavage

site.歐洲共同體易感動物多：家養(yǎng)和野生的禽類、水禽、侯鳥等；水禽（如鴨、鵝）普遍帶毒，并且持續(xù)排毒（1月以上），常常是病毒的重要儲存宿主病毒的復制部位：病毒易在呼吸道、胃腸道及生殖道復制，隨糞便、分泌物及呼氣排出體外，污染飼料、飲水及空氣，傳播給雞，即可引起發(fā)病。三、禽流感的流行病學特點3.

禽流感在雞群體的感染和傳染方式：1）第一，在未免疫群體內(nèi)：a.

高致病HPAI（如H5N1）：雞群內(nèi)個別雞點發(fā)；地區(qū)內(nèi)個別雞群點發(fā)。糞—口，口—口傳播，速度較慢。7-10天可感染全群。低致病性LPAI（如H9N2）： 全群發(fā)??；地區(qū)性流行。直接和間接接觸，特別是空氣和呼吸道傳播，速度快，發(fā)病快。1-2天波及全群。2）第二，在免疫群體內(nèi)：a.

高致病HPAI（如H5N1）：變慢!低致病性LPAI（如H9N2）：變慢!4.禽流感的發(fā)病率和死亡率：低致病性禽流感（LPAI）：未免疫的雞群：---100%發(fā)病，3%左右死亡率；---若并發(fā)大腸桿菌病、慢性呼吸道疾病的雞群死亡增加，可達30%-40%。免疫的雞群：---發(fā)病率、死亡率大大減少。2）高致病性禽流感（HPAI）：未免疫的易感雞群：---幾乎100%發(fā)病和100%死亡。免疫過的雞群：---不會全群死亡。---但可影響雞的生產(chǎn)性能，有一定死亡率流感病毒的進化和傳播水禽家禽豬人馬呼吸fecal/oralAll

HA

and

NserotypesH3N8H7N7H1N1H3N2H1N1H2N2H3N2(H5N1,

H9N2)禽流感–儲存宿主水禽和野生鳥類活禽市場豬維持疫病流行的主要因素抗原變異基因重排和抗原轉變短期免疫交叉種間轉移①有典型的臨床癥狀和病理變化，發(fā)病急、死亡率高，且能排除新城疫和中毒性疾病，血清學檢測陽性。②未經(jīng)免疫雞場的家禽出現(xiàn)H5、H7亞型禽流感血清學陽性。③在禽群中分離到H5、H7亞型禽流感毒株或其他亞型禽流感毒株。確認為發(fā)生高致病性禽流感世界動物衛(wèi)生組織對高致病性禽流感病毒的分類標準是：用0.2毫升1∶10稀釋的無菌感染流感病毒的尿囊液，經(jīng)靜脈注射接種8只4~8周齡的易感雞，在接種后10天內(nèi)，能導致6~7只或8只雞死亡，這些流感病毒應屬于高致病性。分離物能使1~5只雞致死，但病毒不是H5或H7亞型，則應進行下列實驗：將病毒接種于細胞培養(yǎng)物上，觀察其在胰蛋白酶缺乏時是否引起細胞病變或形成蝕斑。如果病毒不能在細胞上生長，則分離物應被考慮為非高致病性禽流感病毒。對低致病性的所有H5和H7毒株和其他病毒，在缺乏胰蛋白酶的細胞上能夠生長時，則應進行與血凝素有關肽鏈的氨基酸序列分析，如果分析結果同其他高致病性禽流感病毒相似，這種被檢驗的分離物應被考慮為高致病性禽流感病毒。如何對禽流感做出鑒別診斷？由于禽流感感染引起的流行特點、癥狀及病理變化與某些禽的傳染病相似，必須及時做出鑒別診斷，如雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎、支原體病、衣原體病、產(chǎn)蛋下降綜合征等；特別是某些疾病的混合感染或繼發(fā)感染，使病情更為復雜，給診斷帶來困難或容易發(fā)生誤診。因此，類癥鑒別診斷十分重要。①瓊脂擴散（AGP）診斷技術。②禽流感病毒亞型分型技術。③禽流感病毒分子診斷與檢測技術。四、禽流感的檢測技術和方法左邊為正常雞雞冠，不腫大呈鮮紅色；

右邊為HPAI病雞，

雞冠腫大、郁血呈

紫黑色HPAIV病死雞腿部皮膚鱗片下出血HPAIV病死雞腺胃乳頭及其間粘膜出血雞胃漿膜出血病死雞卵子變形以至于破裂，卵泡膜出血輸卵管腫脹，內(nèi)膜水腫并有多量白色粘性分泌物頭部出血發(fā)紫，眼眶流液，頭部腫脹頭部出血發(fā)紫，眼眶流液，頭部腫脹，鼻腔流液肉髯出血發(fā)紫，極度腫脹雞腿、雞爪和腳趾出血腿肌出血唯一可見病變：支氣管內(nèi)有特征性的黃色栓塞物目前最新的病變特征：AIV監(jiān)測的方法目前主要有：雞胚接種分離病毒血凝和血凝抑制試驗神經(jīng)氨酸酶抑制試驗ELISA檢測方法免疫熒光方法熒光PCRPCR瓊脂擴散試驗1.雞胚接種分離病毒OIE規(guī)定高致病性禽流感必須通過病毒的分離、鑒定來確診。病毒的分離及亞型鑒定一般至少需要3-5天。病毒的致病性必須通過人工靜脈接種無特定病原雞（SPF雞）來最后確定。病料接種9～11日齡雞胚尿囊液血凝陰性盲傳2－3代血凝陽性免疫擴散ND抗血清HI

排除ND感染特異性核心抗原NP或MPHI

和NI

鑒定A型流感病毒亞型。病毒的分離鑒定對禽流感的診斷比較確實，但操作程序繁瑣，費用多，耗時費力。Virus

isolationGold

standardDone

in

SPF

chicken

embryosNeeded

for

significant

workups

on

samplesGood

samples

for

VI

include

trachea,

lung

and

/or

cloacal

swab

(from

affected

sick

or

deadbirds

best)Genetic

sequencing

/

relationships

may

beestablished

after

virus

isolation對病毒的檢測：目前臨床上多采用多克隆抗體作為標準對照血清，往往出現(xiàn)交叉反應，有時，不同批次出現(xiàn)不同結

果，不容易正確鑒別亞型。單克隆抗體有單位已研制成功H5，H9等，特異性強，結果穩(wěn)定，但尚為正式批量生產(chǎn)，且還沒有抗各種亞型的單抗，有待進一步研究。2.血凝和血凝抑制試驗對抗體的檢測：主要檢測免疫雞群中抗體水平，以及血清流行病學調(diào)查目前的抗原是滅活的病毒H9，H5，H7等但抗原之間有一定的交叉反應，結果不穩(wěn)定。今后的方向是：基因工程表達血凝素 標準化應注意，在HI試驗時，應先除去非特異性凝集反應。許多禽類血清都含有非特異性因子，能和紅

細胞表面受體競爭性地作用于病毒表面的血凝素而

發(fā)生非特異性凝集反應。通常用受體破壞酶（RED）即霍亂菌培養(yǎng)液處理法或高碘酸鈉法制備血清。HA、HI特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費，并且用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的禽流感病毒。過去認為HA所誘導的紅細胞凝集抑制抗體（HI），代表了保護性中和抗體水平。但近年來的研究表明，有些單克隆抗體的HI抗體效價非常高，卻不具備中和能力，說明中和抗體位點與HI抗體位點并不完全一致因此：血凝抑制試驗（HI）檢測結果不能全面代表HA蛋白的免疫效果。3.ELISA檢測方法用表達禽流感病毒核蛋白的桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞，以其表達產(chǎn)物制備抗原，建立了以桿狀病毒系統(tǒng)表達的AIV核蛋白為抗原的禽流感間接（重組核蛋白）ELISA診斷技術（rNP－ELISA)。用ELISA檢測3

138份雞血清：rNP－ELISA與全病毒間接ELISA，AGP及HI的符合率分別為99.9％，97.1％，98.8％;能100％檢出AGP陽性及疑似HI陽性的血清樣品。目前美國Kiregard

Reery和Labortories有試劑盒

出售。ELISA是AI流行病學普查及早期快速診斷的最有效和最實用的方法。1983年R.A.Van．Deusen平板微量NI試驗是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測的快捷方法。美國在80年代火雞發(fā)生流感病毒期間，各次流行所得的血清樣本用微量NI試驗所作出的A型流感病毒亞型鑒定結果已被病毒分離、疫苗接種和流行病學資料所證實。4.神經(jīng)氨酸酶抑制試驗（NIT）中和試驗（NT）常用雞胚或組織培養(yǎng)細胞，操作方法與其他病毒（如NDV）的中和試驗相同。NT試驗是最敏感而特異的血清學方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應，特別是與吸附到宿主細胞上的病毒表面抗原相對應，才能在實驗中取得滿意的效果。因此，某一個血清型的中和實驗機體只與同組內(nèi)的其他病原表現(xiàn)出有限的交叉反應。5.中和試驗（NT）6.PCR建立了一種直接檢測禽糞樣和雞胚尿囊液中AIV亞型RNA的RT－PCR反應，并將此法與AGP和電鏡技術作了比較。RT-PCR靈敏度高，檢測過程僅需到4時左右，并且大大縮短了感染后的檢出時間。應用毛細管PCR（15分鐘30個循環(huán)）代替常規(guī)PCR（2．5個小時30個循環(huán)）以進一步縮短檢測時間，可用于不同樣品（組織、組織液、分泌液、糞便等）的檢測，區(qū)分高致病力毒株和低致病力毒株與非致病力毒株。利用生物學手段，用熒光PCR方法快速檢測禽流感病毒的方法已在北京通過專家鑒定，這一研究成果不僅在國內(nèi)屬于首次，而且在國際上也屬于先進水平。它與國際標準方法雞胚病毒分離相比，不僅無需做雞胚病毒分離培養(yǎng)，而且時間也由原來最短的

21天縮短為4小時。7.熒光PCR8.瓊脂擴散（AGP）診斷技術即用已知陽性血清和未知抗原進行AGP試驗。此法雖然簡單易行，但是敏感性較差，易出現(xiàn)假陽性。AGP最常用的是免疫雙擴散建立的AGP診斷技術及其診斷試劑盒，在全國范圍內(nèi)得到推廣應用，并取得良好的效果。9.免疫熒光方法IFA診斷方法的建立將待檢樣品感染CEF，吸附2h換液，維持12-18h

，固定細胞，一抗37℃孵育

30min，洗滌，二抗37℃孵育30min，洗滌，最后在熒光顯微鏡下觀察。判定標準凡有亮綠色熒光判為陽性反應；無熒光判為陰性反應。圖2：H5單抗與感染AIV-H9CEF的IFA結果圖3：H5單抗與感染NDV

CEF的IFA結果圖4：H5單抗與感染EDS

CEF的IFA結果圖1圖2圖1：H5單抗與感染AIV-H5CEF的IFA結果圖3圖4免疫熒光方法特異性鑒定試驗結果表明

AIV-H9、NDV分別與AIV-H5按不同比例混合感染成纖維細胞，在IFA檢測中都為陽性，說明

AIV-H9和NDV對AIV-H5的復制沒有影響(見表1)。表1：IFA檢測結果病毒AIV-H5+H9AIV-H5+NDVAIV-H5AIV-H9NDVIFA+++——干擾性試驗結果表明用100TCID50(50ul)

SZG010306（A/鵝/中國蘇州/1/01（H5N1））每隔2h感染CEF時，在≥14h時可以檢測到病毒的感染，這表明該方法具有良好的敏感性。圖5

：1

4

h100TCID50(50ul)感染

CEF的IFA結果圖6：10h100TCID50(50ul)感染CEF的IFA結果圖5圖6敏感性試驗序號代號來源CPEAIV-H5MabAIV-H9MabNDVMab1SZG010306蘇州空斑+——2HZ020120杭州空斑+——3金-2-2獸醫(yī)院空斑+——4GXX-6廣西空斑+——5GXX-7廣西空斑+——6GXX-8廣西空斑+——7SYY-1獸醫(yī)院空斑+——IFA方法對部分地區(qū)分離毒株的鑒定在IFA方法檢測中，我們對有血凝性20個分離毒株進行檢測，檢測到8株AIV-H5，2株AIV-H9，10株NDV（見表2）。表2：各地區(qū)分離毒株的鑒定結果序號代號來源CPEAIV-H5MabAIV-H9MabNDVMab8SYY-4獸醫(yī)院空斑+——9XXM江蘇——+—10H9C1江蘇不明顯—+—11GXX-5廣西合胞體——+12GXX-10廣西空斑——+13AHHCC010822宣城合胞體——+14XZ1206徐州合胞體——+15SYYPI34h獸醫(yī)院合胞體——+16KSB昆山合胞體——+17RD011123如東空斑——+18HAC010401海安合胞體——+19KS010305昆山空斑——+20XZ-B徐州合胞體——+肝臟脾臟腎臟腦肺泄殖腔雞胚平均死亡時間84h90h84h90h84h90hIFA結果（24h）++++++表3：24hIFA結果及雞胚平均死亡時間圖8：單抗與感染泄殖腔的CEF在24hIFA結果圖7

：單抗與感染腦組織的CEF在24hIFA結果圖7對人工感染雞泄殖腔及組織雞胚接種和

IFA方法平行檢測圖8對臨床健康雞群泄殖腔樣品的檢測結果對臨床上399份健康雞群泄殖腔樣品進行檢測，結果都為陰性（見表4）。地區(qū)

樣品數(shù)IFA雞胚接種（抽檢）江蘇常州

220份--江蘇江都

60份--安徽寧國

99份--表4：健康雞群檢測結果序號地區(qū)來源24hIFA結果雞胚平均死亡時間HI結果1溫州雞+36.5h+2江陰雞+33h+3濰坊鴨+48h+4如東雞+40h+5濰坊鴨+46h+表6：IFA方法和雞胚接種比較檢測臨床發(fā)病雞群的結果*以上各表中IFA“+”表示用抗AIV-H5單抗與感染的細胞呈亮綠色熒光；HI“+”表示用抗AIV-H5的兔多抗血清與血凝價較高的尿囊液反應有抑制現(xiàn)象。對臨床發(fā)病雞群泄殖腔樣品及病變組織的檢測流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)反向遺傳操作系統(tǒng)（Reverse

Genetics)是人工制造負鏈RNA病毒的技術系統(tǒng)流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)一、依賴輔助病毒系統(tǒng)（Helper

Virus-DependentSystem）RNP轉染系統(tǒng)vRNA聚合酶I系統(tǒng)1989,

Dr.

Peter

Palese

lab

first

developed

thereverse

genetics

with

helper

influenza

virus(Luytjeset

al.,

1989;Enami

et

al.,

1990)

RNP

transfection

method

(A),purified

NP

andpolymeraseproteins

are

assembled

intoRNPs

with

the

use

of

in

vitro-synthesized

vRNA.

Cellsaretransfected

with

RNPs,followed

byhelper

virusinfection.

RNA

polymerase

I

method

(B),a

plasmid

containing

theRNApolymerase

I

promoter

andterminator,

a

cDNA

encodingthe

vRNA

to

be

rescued

aretransfected

intocells.Intracellular

transcription

byRNA

polymerase

I

yieldsvRNA,

which

is

packaged

intoprogeny

virus

particles

uponinfection

with

helper

virus.Ttransfectant

viruses

areselected

from

the

helper

viruspopulation.依賴輔助病毒反向遺傳操作系統(tǒng)構建示意圖流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)二、完全質(zhì)粒系統(tǒng)（Plasmid-Based

Only

System）17質(zhì)粒系統(tǒng)12質(zhì)粒系統(tǒng)8質(zhì)粒系統(tǒng)1999,

Kawaoka

lab

and

Palese

lab

successfully

exploited

a

rescue

system

from

clonedcDNA

(12-17

plasmid).2000,

Webster

lab

developed

an

efficientambisense

rescue

system

(8

plasmid)完全質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)的主要組成部件基礎載體質(zhì)粒啟動子：RNA聚合酶I和RNA聚合酶II啟動子終止子和Poly(A)尾外源基因克隆位點全長的流感病毒基因組cDNA完全質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)的主要組成部件細胞和雞胚：293T、MDCK、Vero、MDBK等報告基因：CAT

(chloramphenicol

acetyltransferase)GAL

(b-galactosidase)GUS

(b-glucuronidase)LUC(luciferase)GFP

(green

fluorescent

protein)完全質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)構建流程I：病毒蛋白的合成RNA

Polymerase

IIpromoterPoly(A)RE—ATG(viral

cDNA)TAA--REViral

Structure

of

non-structure

proteinsmRNA完全質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)構建流程II：病毒RNA的合成RNA

Polymerase

Ipromotert1RE—AAT(viralcDNA)GTA--REvRNA17質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)構建示意圖Neumann,

Gabriele

et

al.

(1999)

Proc.

Natl.

Acad.Sci.

USA

96,

9345-935012質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)構建示意圖Hoffmann

et

al,

2000,

PNAS8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)構建示意圖Hoffmann

et

al,

2000,

PNAS8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)構建示意圖用GFP報告基因檢測vRNP（Polymerase和NP）組裝效果正常細胞轉染后的細胞流感病毒結構與功能研究流感病毒的致病機理PB2蛋白E627K；NS1的拮抗干擾素作用機制流感病毒基因工程疫苗的研究重組H5N1亞型禽流感疫苗研制A型和B型流感病毒嵌合體弱毒疫苗研制流感病毒載體的研究載體疫苗：表達其他病原的免疫原基因基因治療載體：抗腫瘤流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的應用基本對策加強監(jiān)測(尤其是活禽市場）、檢疫、加強對非法商販的打擊力度、生物安全措施農(nóng)業(yè)部制定了HPAI的防制預案嚴禁使用活疫苗，加強疫苗管理、使用與研究H9：自愿免疫H5：早期診斷、劃定疫區(qū)、嚴格封鎖，淘汰陽性雞群，周邊進行緊急免疫H7：禁止免疫四、禽流感的控制措施禽流感疫苗研制方面：已研究出了可用于H5亞型高致病性禽流感緊急免疫預防接種的H5亞型禽流感滅活疫苗。H5N1亞型禽流感重組雞痘病毒活載體疫苗，也已進入環(huán)境釋放階段的安全性評價。1、采取嚴格的生物安全措施和健全的管理制度，防止AIV的傳入：加強消毒，設立消毒池，人員車輛進出消毒，拒絕外來人員參觀；飼養(yǎng)人員進出有條件應沐浴更換衣服；雞舍應裝防鳥、鼠門窗；養(yǎng)雞戶之間應少竄門，少交換飼養(yǎng)工具、飼料和運輸工具如蛋箱等；最好全進全出，避免不同日齡不同批次混養(yǎng)；雞場周圍盡量避免飼養(yǎng)水禽，尤其不能與水禽混養(yǎng)；雞舍、用具和雞群定期消毒；給予全價飼料，雞舍保持通風，及時清除糞便，減少氨氣，保持適宜的溫度濕度密度。2、接種AI油乳劑滅活苗國內(nèi)外的實際應用效果證實：接種禽流感滅活疫苗對預防禽流感非常重要，效果也較好。接種幾次禽流感疫苗為好？（4-5次）參考程序（具體接種時間應根據(jù)各雞群具體抗體情況而定）：

7-12天

一免50-55天二免120天

三免產(chǎn)蛋期間：每3個月再免疫一次對強毒和弱毒流行區(qū)，母源抗體的安全水平線應有所不同，因為二者突破母源抗體的能力可能不一樣。---制定免疫程序時應該考慮該因素。注意：“接種禽流感疫苗后就萬事大吉，不會再發(fā)生禽流感啦”，這種觀點非常錯誤！這是因為：1、流感疫苗是油乳劑滅活苗，疫苗里面的病毒是被滅活的，（因為禽流感疫苗不能用也禁止用活苗），所以只能激發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫而不能產(chǎn)生細胞免疫。2、雞群任何一種疫苗免疫后的效果不是100%，多是正態(tài)分布的，大部分個體處于很好的保護，少部分保護很好，少部分不太理想。3、與雞群接種時所處在的機體的狀態(tài)有一定關系，注射疫苗時雞群應處于健康狀態(tài)，不能處于應激狀態(tài)或免疫抑制狀態(tài)，更不能處于發(fā)