脂質(zhì)體在癌癥診療中的載藥和造影雙重應(yīng)用東南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210009摘要：脂質(zhì)體是由磷脂雙層構(gòu)成的具有水相內(nèi)核的脂質(zhì)微囊，在其水相和脂質(zhì)雙分脂質(zhì)體是一層或多層磷脂雙層膜分散在水中形成的一個類球狀、包封一部分水相的封閉囊泡。早在1947年Bernard就提出了這種存在于水性體系中的兩親分子囊泡性結(jié)構(gòu)的假設(shè)，但直到1962年劍橋大學(xué)動物生理學(xué)研究所裝備了電子顯微鏡后，AlecD.Bangham才和他的同事于1965年正式提出脂質(zhì)體的概念【1】。由于磷脂雙分子層具有和細(xì)胞膜類似的結(jié)構(gòu)，所以其具有良好的生物相容性。脂質(zhì)體進(jìn)入人體內(nèi)會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，主要在肝、脾和骨髓等組織器官中積蓄，從而具有天然的被動靶向性；如果再對其修飾上特定的配體，又可主動的靶向某些部位。這些性質(zhì)使其可作為良好的藥物和其他試劑的載體。人體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能一般是看不見的，但人們借助各種科學(xué)技術(shù)將人體內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能形成圖像，于醫(yī)學(xué)。從20世紀(jì)50年代開始，醫(yī)學(xué)成像的發(fā)展突飛猛進(jìn)，新的成像系統(tǒng)相繼出現(xiàn)。X射線包括CT主要用于觀察人體形態(tài)學(xué)上的特征。采用放射性核素的核素成像可以了解臟器的生理功能。單光子發(fā)射病的研究和診斷大為深入。磁共振成像(MRI)從另一角度些事了人體內(nèi)部狀況，它的圖像與體內(nèi)生化過程有關(guān)；它既是功能性的又比核素成像更清晰，而且對人體損傷很小。超聲成像與這些方法相比價(jià)格低廉，信號或增強(qiáng)信號需要用到顯影劑或造影劑，脂質(zhì)體具有作為這些試劑載體的潛力。隨著科技的發(fā)展，成像技術(shù)在許多疾病特別是癌癥的診斷和治療中的重要性急劇增加。在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成像和治療結(jié)合的趨勢明顯。經(jīng)過改造的脂質(zhì)體可以選擇性的靶向腫瘤組織，并能同時(shí)攜帶藥物和造影劑，這使得脂質(zhì)體在診療一體化方面有很大的潛力。本文將重點(diǎn)對脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物和各類成像技癌癥是人類的大敵，目前治療癌癥的主要手段還是化療，而提高化療效果的關(guān)鍵是提高藥物的靶向性和降低藥物的毒副作用。脂質(zhì)體作為抗癌藥物載體的幾個關(guān)鍵問題是如何提高藥物的包封率、靶向性及達(dá)1.1載藥脂質(zhì)體的制備技術(shù)簡介【3】載藥脂質(zhì)體的制備涉及到兩個重要方面：一是脂質(zhì)體的形成，二是藥物的裝載。如果脂質(zhì)體形成和藥物裝載在同一步完成，則稱為被動載藥制備技術(shù)。如果先形成空白脂質(zhì)體，再借助特定的梯度來實(shí)現(xiàn)藥物的裝載則稱為主動載藥制備技術(shù)。1.2.1被動載藥制備技術(shù)被動載藥制備技術(shù)通常只適用于那些和脂類物質(zhì)(尤其是磷脂)有強(qiáng)烈互相作用的脂溶性或親脂性藥物，否則就會造成：藥物的包封率和載藥量不足；當(dāng)脂質(zhì)體以液體形式儲存時(shí)，藥物會從脂質(zhì)體中大量滲漏；對稀釋效應(yīng)特別敏感。影響脂質(zhì)體體外穩(wěn)定性和體內(nèi)行為的因素主要有尺寸及分布、磷脂組成、膽固醇含量、層數(shù)，以及上述因素決定的荷電性，相轉(zhuǎn)換溫度T以及膜的通透性、彈性、剛性等。選擇合適的m制備方法，就是要對上述因素進(jìn)行控制。鑒于脂質(zhì)體的制備方法眾多，有必要采取一個合理的分類手段，下面就以出發(fā)體系的不同分類歸納。以干燥的脂膜、脂類粉末為基礎(chǔ)的制備方法有：薄膜分散法、有機(jī)溶劑凍干法、噴霧干燥法、硫化床包衣法、單相溶液凍干法。以乳劑為基礎(chǔ)的方法有：反相蒸發(fā)法、二次乳化法。以混合膠團(tuán)為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體制備方法。以乙醇、磷脂、水三相混合物為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體制備方法。1.2.2主動載藥制備技術(shù)使用主動載藥技術(shù)，對藥物的性質(zhì)有較嚴(yán)格的要求。需要藥物在生理pH值附近有可以離解的基團(tuán)，具有合適的油水分布系數(shù)，并且和脂質(zhì)體的內(nèi)相緩沖液可以生成穩(wěn)定程度恰當(dāng)?shù)膹?fù)合物或者沉淀。其制備工藝通常包括：制備空白脂質(zhì)體；通過透析、柱層析等手段創(chuàng)造特定的梯度；在合適的溫度下，將膜內(nèi)外已經(jīng)形成梯度的空白脂質(zhì)體和待包封的藥物孵育，以完成藥物的裝載。最常用的梯度為pH梯度和硫酸銨1.2脂質(zhì)體對腫瘤組織的靶向技術(shù)【3】被動靶向是依賴于人體器官或組織本身的生理特征和差異而達(dá)到選擇性富集的目的。由于腫瘤的快速且不受控制的生長和組織的炎癥會造成血管泄漏，這種泄漏的血管的內(nèi)皮細(xì)胞層之間的間隙可達(dá)到700nm,這使得脂質(zhì)體能夠外滲到病變組織的細(xì)胞外空間。由于腫瘤組織中淋巴系統(tǒng)的失效和血管與間隙之間的壓力差使得脂質(zhì)體會滯留在細(xì)胞外空間。這被稱為實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR-effect)，被動靶向就是運(yùn)用這種效應(yīng)達(dá)成的。如果通過在脂質(zhì)體表面連接特定的配體就可以靶向那些腫瘤組織中過表達(dá)的受體或腫瘤血管上高表達(dá)的標(biāo)志物。這就能實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體的主動靶向，主動靶向也可結(jié)合EPR-effect來達(dá)到脂質(zhì)體在腫瘤部位的累積。靶向配體包括抗體、抗體片段、多肽、核酸適配體以及一些小分子如葉酸和糖類。應(yīng)該注意，無論哪種靶向技術(shù)都要面臨傳統(tǒng)脂質(zhì)體在體內(nèi)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的問題，所以延長脂質(zhì)體在體內(nèi)的存留時(shí)間提高在體內(nèi)循環(huán)的穩(wěn)定性是非常重要的，通常可采用不同長度的脂肪酸鏈、不同的飽和度、改變荷電性以及采用空間穩(wěn)定劑等方法實(shí)現(xiàn)。最常用的就是采用聚乙二醇(PEG)來保護(hù)脂質(zhì)體。各種配體也可接到PEG上來實(shí)現(xiàn)靶向。被動靶向和主動靶向的示意圖參見圖1。1.3脂質(zhì)體的選擇性釋藥技術(shù)在脂質(zhì)體的設(shè)計(jì)中，通過外力或利用一些物理化學(xué)因素的改變可使脂質(zhì)體膜的通透性發(fā)生明顯改變，引起脂質(zhì)體選擇性的釋放藥物。常見的有溫度敏感脂質(zhì)體、pH敏感脂質(zhì)體、聲波敏感脂質(zhì)體等，這些技術(shù)可以單獨(dú)使用也可以結(jié)合起來使用。下面結(jié)合最新研究進(jìn)展分別介紹。1.3.1通過溫度控制脂質(zhì)體藥物釋放不同溫度下磷脂膜可以有不同的相，隨著溫度的升高，磷脂膜從緊密排列的凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷苫靵y的液晶態(tài)，膜的流動性也增大。這種結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致脂質(zhì)體膜的通透性發(fā)生改變，從而到達(dá)選擇性釋放的目的。傳統(tǒng)的溫度敏感脂質(zhì)體常選用相轉(zhuǎn)變溫度略高于人體溫度的天然磷脂(如二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC，相變溫度41℃)或合成聚合物來制備，再在腫瘤部位進(jìn)行熱療。最近出現(xiàn)了用亮氨酸拉鏈組裝到磷脂雙分子膜的脂質(zhì)體裝載阿霉素進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的報(bào)道[5],這種溫度敏感的多肽可以在溫度的調(diào)控下最大化藥物釋放率。其機(jī)理如圖2所示。1.3.2通過pH控制脂質(zhì)體藥物釋放pH敏感脂質(zhì)體是一種由不飽和的PE和脂肪酸組成的在酸性條件下主動釋藥的脂質(zhì)體。其原理是:脂質(zhì)體被細(xì)胞內(nèi)吞后,形成核內(nèi)體。核內(nèi)體為酸性,使脂肪酸羧基質(zhì)子化,發(fā)生膜融合,藥物便釋放到胞漿,避免進(jìn)入溶酶體被降解。目前為了提高抗癌藥的療效,幾種抗癌藥的pH敏感脂質(zhì)體制劑已被研制。最近有靶向線粒體且分階段pH響應(yīng)的脂質(zhì)體作為抗癌藥物載體的報(bào)道【6】，該脂質(zhì)體是基于一種兩性寡肽脂質(zhì)體(HHG2C-L),HHG2C-L由兩部分組成：一部分親和一個對pH響應(yīng)性分解的基團(tuán)(氨基六氫苯甲酸)組成；另一部分疏水，由兩條硬脂烷烴鏈組成。可以在體內(nèi)不同的微環(huán)境下做出相應(yīng)的反應(yīng)。詳細(xì)過程參見圖3。1.3.3通過超聲控制脂質(zhì)體藥物釋放超聲對脂質(zhì)體釋藥的控制可通過超聲的致熱效應(yīng)或非致熱效應(yīng)的方式來達(dá)成。通過高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)可以非侵入性的定位控制溫度敏感性脂質(zhì)體[7]，如圖4所示。通過低頻率超聲(LFUS)通過非致熱效應(yīng)來控制脂質(zhì)體釋放藥物可以不改變藥物的化學(xué)完整性或生物效力，這里我們重點(diǎn)介紹一下利用低頻超聲的低頻超聲可以使脂質(zhì)體釋放藥物的重要原因是可以在磷脂雙分子膜上形成瞬時(shí)孔隙。形成機(jī)解釋制如形成一個穿孔，此時(shí)藥物就可以從脂質(zhì)體的水相內(nèi)核釋放到脂質(zhì)體外的水相中；然后磷脂膜松弛并回復(fù)到2脂質(zhì)體在醫(yī)學(xué)成像及診療一體化中的應(yīng)用在運(yùn)用脂質(zhì)體作為各種成像技術(shù)的顯影劑載體時(shí)，一種思路是按成像原理的不同分開研究的。也取得了很多進(jìn)展，如用碘化的脂質(zhì)體造影劑作為CT成像在老鼠原發(fā)肺癌的診斷中的應(yīng)用[9],利用脂質(zhì)體作為放射性核素的載體用于SPECT和PET在腫瘤診斷中的應(yīng)用已經(jīng)有了綜述[4],利用脂質(zhì)體攜帶磁性納米顆粒作為MRI在腫瘤的診斷中的應(yīng)用也有了綜述[7,10],脂質(zhì)體作為超聲成像的造影劑在上世紀(jì)九十年代研究較多，也有過專利[11],近期在超聲造影方面應(yīng)用較多的是納米微氣泡，因?yàn)檫@種微氣泡含有更大的氣體內(nèi)核，但實(shí)際上和脂質(zhì)體也是密不可分的[12]。由于各種成像技術(shù)都有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，在診斷方面人們越來越傾向于多種成像技術(shù)同時(shí)運(yùn)用，這樣可以同時(shí)從不同的方面來了解患者的狀況；由于很多時(shí)候體內(nèi)輸送藥物和運(yùn)送造影劑用的是類似的系統(tǒng)，人們也更傾向于將診斷和治療合二為一，即將成像和載藥結(jié)合起來，這樣可以提高效率也可以對于藥物治療的效果進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)控。下面將結(jié)合最近的幾篇有代表性的文獻(xiàn)來介紹一下多種成像的綜合運(yùn)用以及診斷治療一體化方面的進(jìn)展。2.1造影劑與脂質(zhì)體的結(jié)合不同的顯影劑或造影劑的性質(zhì)各異，但與脂質(zhì)體的結(jié)合方法可以歸納為四類：被動包封、膜標(biāo)記、表面螯合、遠(yuǎn)端裝載。這里用放射性核素標(biāo)記脂質(zhì)體的示意圖來說明，如圖4所示。2.2利用MRI引導(dǎo)HIFU來控制熱敏性脂質(zhì)體釋藥【7】溫度敏感性脂質(zhì)體的概念前面已經(jīng)介紹過，臨床上的加熱方式主要有水浴、光照、基于針尖的射頻、導(dǎo)管加熱等；利用高強(qiáng)度聚焦超聲作為一種無損、定位、可控的加熱方式展現(xiàn)出很大的應(yīng)用前景。將藥物和MRI造影劑同時(shí)包封于脂質(zhì)體內(nèi)，就可以實(shí)現(xiàn)載藥和造影的雙重功效。如圖7所示。利用MRI引導(dǎo)HIFU可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)深部的精確靶向定位和實(shí)時(shí)溫度變化定量控制，這樣就可以先用MRI對腫瘤的治療制定計(jì)劃，在治療中可以提供溫度及空間的反饋，也可以對治療效果進(jìn)行評價(jià)。整個過程參見圖8的循環(huán)。這樣一個系統(tǒng)可以顯著提高靶組織的藥物聚集量。MRI是一種非侵入性的和廣泛使用的成像模式，能產(chǎn)生良好的軟組織對比度和空間分辨率。然而MRI但空間和時(shí)間分辨率的靈敏度有限。因此有必要結(jié)合這些成像模式來闡明脂質(zhì)體從細(xì)胞水平到宏觀水平的生物行為。能將載藥系統(tǒng)和這些成像模式結(jié)合就更有意義了。這里介紹一種多功能，多模式的組裝脂質(zhì)體劑型，包括：含有短的n-乙二醇(n-EG)單元的脂質(zhì)用于在體內(nèi)包覆脂質(zhì)體，連接1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的脂質(zhì)可以在體內(nèi)螯合順磁性離子或放射性核素，熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體用于光學(xué)成像，輔助性脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。并設(shè)計(jì)合成了三種在DOTA和磷脂酰基鏈間有不同長度的n-EG的脂質(zhì)。在DOTA極性頭上接上順磁性的Gd3+離子，就可以使脂質(zhì)體成為MRI造影劑，接上放射性離子64Cu和111In，就可以作為PET或SPECT的示蹤劑。為了能延長循環(huán)時(shí)間及更好的靶向我們采用PEG2000修飾的脂質(zhì)體。詳細(xì)如圖9所示。脂質(zhì)體由于其良好的生物相容性，靶向性和膜通透性的可控性，作為藥物的載體和造影劑的載體的研究已經(jīng)開展的很多年了