放射免疫分析第1頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月目的與要求：掌握放射免疫分析的基本原理，實驗室配置及質(zhì)量控制。內(nèi)容：放射免疫分析(RIA)是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的一種體外放射分析技術(shù)。這是檢驗專業(yè)學生必須掌握和重點。2第2頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基本原理一、必須掌握放免分析的基本原理：放射免疫分析是在體外條件下，由非標記抗原與定量的標記抗原對限量的特異性抗體的競爭性抑制的反應。3第3頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月參加反應的有標記抗原、非標記抗原(標記抗原或待測抗原)和特異性抗體，如下幾點必須透徹理解：

1、標記抗原與非標記抗原和特異抗體結(jié)合的能力被認為是相同的。

2、標記抗原與特異性抗體結(jié)合形成標記抗原抗體復合物，非標記抗原與特異性抗體結(jié)合形成非標記抗原抗體復合物。4第4頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、標記抗原與非標記抗原之和多于物質(zhì)異性抗體結(jié)合位點。這樣當反應達到平稀時，標記抗原抗體復合物的生成量受非標記抗原數(shù)量的制約。例如：非標記抗原數(shù)量增加時，就會抑制標記抗原與抗體的結(jié)合，標記抗原抗體復合物的生成量就減少，未與抗體結(jié)合的標記抗原的數(shù)量加。這種特異性的競爭性抑制的數(shù)量關系就是放射免疫分析的定量基礎。標記抗原與被測物質(zhì)間的數(shù)量關系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結(jié)合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數(shù)關系，也稱為劑量反應曲線。5第5頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月二、劑量反應曲線劑量反應曲線又稱標準曲線。是放射免疫分析定量的基礎，是衡量物質(zhì)濃度的客觀尺度(一)標準曲線的手工繪制形態(tài)標準曲線的形態(tài)可因所用的反應變量表達形式的不同，或所采用坐標系統(tǒng)不同而有不同的形態(tài)。(二)標準曲線的基本數(shù)學函數(shù)式放射免疫分析從抗原抗體反應動力學分析，反應是雙向性的，服從質(zhì)量作用定律。6第6頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月

(三)掌握親和常數(shù)K值的計算、意義及應用、平衡常數(shù)K又稱親和常數(shù)，或叫做結(jié)合常數(shù)。該常數(shù)對特定的抗原抗體反應系統(tǒng)是固定不變的。K的單位為1mol或L/mol。其意義在于可用K值反映抗體之間的親和力。K值與游離抗體濃度呈反比關系。K值越大，則游離的抗體濃度［Ab］越小，結(jié)合的抗原抗體復合物［Ag-Ab］濃度越大。即抗原抗體的結(jié)合力越大。K值是與抗原抗體共同相關的數(shù)值，不能認為僅僅是抗體(或抗原)之間的K值。目前，國內(nèi)外有多種計算K值的方法，有的非常復雜，而通常使用的方法是Scatchard分析作圖法。7第7頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)掌握標準曲線的斜率對測定的影響標準曲線的斜率對放射免疫分析方法的靈敏度和精密度均有影響。影響標準曲線斜率的因素：

1、親和常數(shù)K2、標記抗原和標準抗原的用量

3、特異性抗體的用量(五)掌握Bo(總結(jié)合)、T(總管)、NSB的概念8第8頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)放射免疫分析方法學一、掌握建立放射免疫分析方法的必備條件(一)對標準抗原的基本要求

(1)標準抗朱與待測抗原的免疫性必須一致，即它們與抗體的親和力和特異性應相同。標準抗原與待測抗原所處的介質(zhì)條件應基本相同。

(2)抗原必須純度度。

(3)標準抗原的量必須準確。

(4)標準抗原應有很好的穩(wěn)定性。9第9頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)對抗血清的要求抗血清中含有對其相應抗原的特異性抗體。目前常以抗原免疫年輕、健康的純種小動物而誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體，選取抗體滴度高的血清，為RIA所用?？寡宓馁|(zhì)量直接影響放射免疫分析方法的靈活敏度和特異性。檢查抗血清質(zhì)量的指標主要有親和常數(shù)(K)、免疫交叉反應率及滴度(或抗體效價)。10第10頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)對標記抗原的要求標記抗原是放射性測定的依據(jù)，對標記抗原的基本要求：1、標記抗原的免疫活性與待測抗原及標準品必須一致。2、標記抗原要有適當高的放射性比活度。3、標記抗原應具有足夠高的放射化學純度11第11頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)分離B與F的方法理想分離應滿足如下要求：1、分離B、F完全、快速。2、不影響免疫反應的平衡條件。3、不受分離操作時的環(huán)境因素(如pH、溫度等)的影響。4、操作簡便，分離試劑的來源豐富且價廉。12第12頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月目前的分離方法有：1、非特異性分離法(1)吸附法：利用表面活性物質(zhì)將反應的液中小分子游離部分F吸附，通過離心，將F沉淀，使大分子結(jié)合物B留在上清液中，而達到分離的目的。(2)過濾法：反應液中B與F混合物在通過一定規(guī)格孔徑的濾膜時，大分子不會通過濾膜孔被阻留在濾膜上，小分子游離的放射性物質(zhì)F被抽吸通過濾膜而分離。(3)沉淀法。13第13頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月2、特異性分離法

(1)雙抗法(Ab2法)：應用抗IgG的第二抗體來分離B和F的方法稱為雙抗體法。雙抗體法具有特異、高效、非特異性結(jié)合低、重復性好等優(yōu)點。在使用此法時，往往加入適量的第一抗體同種動物血清作載體。同時第二抗體必須是過量(但也不宜過大)，且以不影響反應平衡為宜.(2)固相分離法：將特性抗體(第一或第二抗體)或抗原結(jié)合在固相物質(zhì)。

(3)金黃色葡萄球菌A蛋白分離法。14第14頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月二、掌握放射免疫分析的設計方法：(一)標譏抗原和抗體用量最佳化設計。1、標記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法。(二)標準抗原劑量設計1、標準抗原劑量范圍2、標準曲線工作范圍(三)加樣順序設計(四)反應介質(zhì)15第15頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月(五)反應容積與溫度及時間

1、反應容積縮小反應容積可相應減少抗體和標記抗原的絕對用量，使非標記抗原的競爭力相應增強，有利于提高靈敏度，使反應試劑消耗減少。

2、溫育溫度和時間抗原、抗體結(jié)合反應的平衡結(jié)合常數(shù)K與溫度有關必須通過實驗來確定最佳工作條件。(六)B與F分離方法選擇(七)樣品采集與保存16第16頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)放射免疫分析的質(zhì)量控制一、掌握誤差和放射免疫誤差的來源

(一)誤差及其分類

(二)放射免疫分析誤差來源二、掌握質(zhì)量控制與質(zhì)控樣品

(一)放射免疫分析的質(zhì)量控制內(nèi)容

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