缺血性心臟病藥PPT822023/7/17缺血性心臟病藥PPT82一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)根據(jù)缺血性心臟病(心絞痛、急性心肌梗死)的主要癥狀發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范疇。病位以心腎為主。基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)。本虛以臟氣虧虛為主．可兼陰虛；標(biāo)實(shí)以血瘀痰阻多見，可兼氣滯、寒凝?；局畏樾酝枺钛?，芳香溫通及扶正固本。缺血性心臟病可由不同病因引起，最常見的原因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈血栓及冠狀動(dòng)脈痙攣。其共同特點(diǎn)是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而發(fā)生的一系列病理生理改變及證候。改善心臟血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代謝，緩解心絞痛，減小心肌梗死面積是藥物治療的主要目的。二、藥效學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)缺血性心臟病需要進(jìn)行的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)較多，—般應(yīng)以整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)藥物特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)選用器官、組織、細(xì)胞及分子水平的實(shí)驗(yàn)，多層次實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，有利于重復(fù)驗(yàn)證和說明作用原理。但由于缺血性心肌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，防治的途徑，方法及藥物類型亦較復(fù)雜。應(yīng)明確研究的思路，作用的途徑，選擇適宜的主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法及必要的觀測指標(biāo)，進(jìn)行止確的分析判斷，以求得科學(xué)的結(jié)論。缺血性心臟病藥PPT82

(一)對心肌缺血心肌梗死的防治作用試驗(yàn)1．常用動(dòng)物模型(1)冠狀動(dòng)脈阻斷或縮窄形成心肌缺血和心肌梗死模型：通過阻斷或縮窄冠狀動(dòng)脈方法，如結(jié)扎、電刺激、氣囊法，血管內(nèi)異物法及注入凝血酶或ADP法等。(2)藥物誘發(fā)心肌缺血模型：通過藥物誘發(fā)冠脈痙攣法，如垂體后葉素、麥角新堿，以及通過增加心肌耗氧法，如異丙腎亡腺素等。(3)離體實(shí)驗(yàn)心肌缺血模型：結(jié)扎離體心臟冠狀動(dòng)脈法、離體心臟低氧或無氧灌流法。(4)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血樣損傷模型：控制心肌細(xì)胞的供氧和培養(yǎng)基中的含糖量，形成“缺血樣損傷”模型。(5)心肌缺血冉灌注損傷模型：整體動(dòng)物心臟缺血再灌注損傷．離體心臟和心肌細(xì)胞缺氧缺糖再灌注損傷等模型。以上心肌缺血模型第一項(xiàng)可用于急性和慢性心肌缺血實(shí)驗(yàn)，可觀察藥物的藥理作用、起效及作用時(shí)間等。其余均為急性心肌缺血模型，可作藥物作用機(jī)制分析研究。缺血性心臟病藥PPT822．觀察指標(biāo)(1)直接測定心肌梗死范圍：①大體標(biāo)本活體染色法，以定量組織學(xué)(N—BI'染色或TIC染色或雙重染色)觀察心肌梗死面積的改變。②病理切片顯微鏡檢查，鏡下觀測心肌病變程度和范圍。③病理切片熒光照相法，利用四環(huán)素能與心肌壞死細(xì)胞中的鈣整合的特性，在切片上進(jìn)行熒光照相，以測定梗死面積。④電子顯微鏡觀察細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核及染色質(zhì)等心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。(2)間接測定心肌梗死范圍：①心外膜電圖標(biāo)測法，阻斷或縮窄冠狀動(dòng)脈形成心肌缺血及心肌梗死，以多點(diǎn)心外膜電圖標(biāo)測心肌缺血的程度和范圍的變化。②酶學(xué)指標(biāo)觀測，測定血中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)等與心肌損傷相關(guān)的酶類變化，動(dòng)態(tài)觀察心肌損傷情況，定量分析心肌損傷程度。③核示蹤法，將肘心肌壞死有親和力的物質(zhì)進(jìn)行核索標(biāo)記來觀察梗死情況，常用的有锝—四環(huán)素和锝—焦磷酸亞錫。

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(3)缺血區(qū)測定指標(biāo)：①染料及熒光素法，通過從冠脈注入染料或熒光素，然后進(jìn)行肌切片觀察心臟血流灌注情況，從而計(jì)算無染料(或熒光)的面積(即缺血面積)，如合并應(yīng)用N—BT做活體雙重染色法可計(jì)算梗死面積與缺血面積的比值。②核示蹤法，利用放射核鉈依靠鈉泵進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)而不能進(jìn)入缺血或壞死細(xì)胞的特點(diǎn)，通過閃爍照相來觀察心肌缺血部位及范圍。③放射自顯影法觀察缺血區(qū)。④心表面熒光法，用表面熒光照相來分析缺血K情況。⑤冠脈血流量、冠脈返流量及返流壓的測定。⑥心肌區(qū)域血流量的測定。(4)其他可供分析的指標(biāo)：心肌代謝指標(biāo)，如心肌氧代謝，其他物質(zhì)及能量代謝，如FFA、ATP、PGI2、TXA2、cAMP/cGMP，SOD、MDA、乳酸、鉀、鈣、鎂離子、血凝狀態(tài)及血液流變性等。缺血性心臟病藥PPT82

3．方法學(xué)評(píng)價(jià)以上各項(xiàng)試驗(yàn)方法中，以阻斷動(dòng)物的冠狀動(dòng)脈所致之局限性心肌缺血是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的方法，通過狹窄或完全閉塞冠狀動(dòng)脈，使其供應(yīng)區(qū)的血流減少或缺無，造成心肌缺血，心肌因缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂，以致發(fā)生凝固性壞死，其發(fā)病過程和機(jī)制與臨床相似，與中醫(yī)理論“瘀血證”有一定聯(lián)系，較為合理、實(shí)用?？筛鶕?jù)所試藥物功能、主治和作用特點(diǎn)選用上述形態(tài)、電生理、生化、放免、核示蹤、熒光等觀測指標(biāo)與方法，可以定位、定性、定量的觀測缺血心肌的動(dòng)態(tài)變化及藥物影響，較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)藥效。應(yīng)作為新藥主要藥效學(xué)的首選試驗(yàn)。缺血性心臟病藥PPT82(二)對心臟血流動(dòng)力學(xué)及心肌耗氧量影響試驗(yàn)1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與觀測指標(biāo)(1)犬心功能及血流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)：觀察指標(biāo)應(yīng)包括心電圖、心率。動(dòng)脈血壓、冠脈流量，冠脈阻力、心輸出量、心肌收縮力、左室做功、左室內(nèi)壓、左室內(nèi)壓最大上升速率、心搏出量、心臟指數(shù)、心搏指數(shù)、總外周阻力等，并可同時(shí)測定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指數(shù)等。(2)貓、鼠等其他動(dòng)物心功能及血流動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)：觀察指標(biāo)應(yīng)包括心電圖、心率，動(dòng)脈血壓、心輸出量、左室內(nèi)壓、左室內(nèi)壓最大上升速率、中心靜脈壓、左室別血的張力指數(shù)、左室作功指數(shù)、心臟指數(shù)、左室舒張未期壓等。(3)無創(chuàng)性心功能檢查：如超聲心動(dòng)圖、阻抗圖、Y—照相等。2．方法學(xué)評(píng)價(jià)心臟血流動(dòng)力學(xué)、心肌耗氧量等應(yīng)作為評(píng)階藥物作用及作用機(jī)制的重要指標(biāo)，對于了解藥物對心肌功能、血管順應(yīng)性、心肌供血及心肌氧代謝的影響，結(jié)合對心肌缺血、心肌梗死等指標(biāo)的影響，作綜合性評(píng)價(jià)有重要意義。缺血性心臟病藥PPT82(三)其他試驗(yàn)1．血小板聚集性試驗(yàn)血小板聚集性增強(qiáng)是造成血液循環(huán)障礙導(dǎo)致心肌缺血發(fā)生的重要原因之一。藥物對動(dòng)物血小板聚集性的影響可作為藥效學(xué)研究的輔助指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用兔或大鼠。以三磷酸腺稈、花生四烯酸(AA)、膠原、凝血酶等作為繡導(dǎo)劑，應(yīng)用比濁法或其他方法測定。2．血栓形成及溶栓試驗(yàn)冠狀動(dòng)脈血栓形成是直接導(dǎo)致心肌缺血因素之一。對血栓形成的影響和溶栓作用應(yīng)為評(píng)價(jià)治療心肌缺血藥物藥效的輔助指標(biāo)。常用免或大鼠以Chmldlcr血栓形成法，測定心栓的重量及長度；應(yīng)用大鼠以動(dòng)—靜脈旁路法測定血栓濕重；電刺激人鼠頸總動(dòng)脈形成動(dòng)脈血栓，用以觀察藥物對體內(nèi)血栓形成時(shí)間的影響;電刺激犬或豬的冠狀動(dòng)脈形成冠狀動(dòng)脈血栓，以心肌缺血程度范圍、心肌梗死、心肌酶及冠脈血栓占管腔的百分比等多項(xiàng)指標(biāo)綜合觀察藥物對心肌缺血的防治作用和溶栓作用。

缺血性心臟病藥PPT823．血液流變學(xué)試驗(yàn)心肌缺血發(fā)生前后，常伴有血液流變學(xué)改變。因此，測定血液黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞沉降、血小板黏附和聚集等血液流變學(xué)指標(biāo)，對評(píng)價(jià)藥物的作用有重要意義。4．氧代謝試驗(yàn)增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代謝是藥物治療缺血心臟病的重要作用。方法除前面介紹的心肌耗氧量測定外，可同時(shí)選用小鼠常壓、低壓耐缺氧等實(shí)驗(yàn)和指標(biāo)。缺血性心臟病藥PPT82(四)陽性對照藥陽性對照藥既可選擇西藥，也可選中藥。西藥作用明確，療效肯定，尤其是一些經(jīng)典藥品，可檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法可靠性。西藥劑量與中藥量相差較大，作用特點(diǎn)亦不大相同，不做藥效強(qiáng)度比較。采用中藥陽性藥時(shí)，一股應(yīng)選療效肯定的功能主治相似的中成藥對照，對照藥應(yīng)是藥典記載或經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)生產(chǎn)的；對照藥劑應(yīng)與受試藥等效或相當(dāng)，以便進(jìn)行比較，同一受試藥的不同藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)選用不同的陽性對照藥。缺血性心臟病藥PPT82

三、動(dòng)物模型建立方法(一)犬或小型豬心肌缺血及心肌梗死模型1．原理通過縮窄或完全閉塞冠狀動(dòng)脈，減少或停止供應(yīng)區(qū)的血流，形成心肌缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂，以致發(fā)生心肌壞死。2．方法健康成年犬或小豬(現(xiàn)我國已培育出實(shí)驗(yàn)用“中國實(shí)驗(yàn)小型豬”)，雌雄兼用，體重10—15kg，經(jīng)戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉，手術(shù)臺(tái)固定，分離氣骨并插管，連接電動(dòng)呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量300—600wi，動(dòng)脈氧分壓維持在12—13kPa(90-100mmHg)，血pH在正常范圍；左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，做心包床；分離冠狀動(dòng)脈左前降支中段(一般相當(dāng)廠第三分支根部)，可用以下兒種方法阻斷冠狀動(dòng)脈，形成心肌缺血：(1)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法：在冠脈分離處穿3—4號(hào)處線以備結(jié)扎，或用動(dòng)脈夾阻斷，一般用于急性心肌缺血實(shí)驗(yàn)。(2)冠狀動(dòng)脈血栓形成法：將弧型針狀電極(刺激電極)置于分離的冠狀動(dòng)脈下，另一電極(參考電極)距刺激電極o．6mm處置于心外膜下，兩電極分別連接電刺激儀的隔離器正負(fù)極，以2．5、lmA直流電刺激冠狀動(dòng)脈30min左右，冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成，阻斷冠狀動(dòng)脈血流，誘發(fā)心肌缺血。缺血性心臟病藥PPT82(3)冠狀動(dòng)脈氣囊壓迫法：壓迫環(huán)由有機(jī)玻璃外套和可膨脹的乳膠小囊構(gòu)成，外套長5mm側(cè)面lmm的縫隙，血管由此進(jìn)入肺內(nèi)，小囊長3—4mm，一端密閉，一端與塑料管相連，充滿蒸餾水或生理鹽水，經(jīng)塑料管注水30—40ul使小囊膨脹以壓迫套內(nèi)的血管，當(dāng)壓力去除時(shí)，小囊恢復(fù)原狀，冠狀動(dòng)脈重新通暢，適用于急性和慢性心肌缺血或再灌實(shí)驗(yàn)。(4)Ameroid縮窄環(huán)法：為形成慢性冠狀動(dòng)脈閉塞、心肌缺血或觀察冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的變化，用具有吸水性的塑料環(huán)(Ameroid環(huán))套在冠狀動(dòng)脈左旋支根部。關(guān)閉胸腔后，塑料環(huán)吸收組織水分膨脹，環(huán)外殼系硬質(zhì)材料做成，限制環(huán)的外展，結(jié)果壓迫冠狀動(dòng)脈，形成心肌缺血。環(huán)植人4—6星期，血骨內(nèi)徑縮小80％-90％。(5)清醒動(dòng)物心肌缺血實(shí)驗(yàn)：將氣囊壓迫環(huán)固定在冠狀動(dòng)脈適當(dāng)部位，縫合心包，放置心包膜電極，氣囊的導(dǎo)管電極的導(dǎo)線分別穿過胸壁引出皮外，逐層縫閉胸。實(shí)驗(yàn)時(shí)注入蒸餾水，使氣囊膨脹，壓迫冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血，測量心外膜電圖或其他觀察指標(biāo),本法可反復(fù)阻斷冠狀動(dòng)脈，進(jìn)行多次清醒動(dòng)物的心肌缺血實(shí)驗(yàn)及再灌注損傷實(shí)驗(yàn)。(6)缺血再灌注創(chuàng)傷：在心肌缺血一定時(shí)間造成心肌損傷后，冉供血一定時(shí)間，加重心肌損傷而形成再灌注損傷，觀察藥物的保護(hù)作用。缺血性心臟病藥PPT823．藥物療效判斷(1)心外膜電圖標(biāo)測：心外膜標(biāo)測點(diǎn)的定位應(yīng)包括缺血中心區(qū)、邊緣區(qū)和非缺血區(qū)，標(biāo)測方法：將心電極固定于具有一定彈性的無刺激性材料作成的片子上，該片四角縫于心外膜，如多點(diǎn)固定式心外膜電極。或直接將每個(gè)電極固定于心外膜表面，或用一個(gè)燈芯電極按順序點(diǎn)測標(biāo)測點(diǎn)。或用一個(gè)電極沿心表山一定途徑移，記出一個(gè)連續(xù)的心外膜電曲線。電極用浸泡生理鹽水的燭芯棉線或細(xì)毛筆尖等柔軟材料探查電極，聯(lián)于心電圖胸前導(dǎo)聯(lián)描記，用普通心電圖機(jī)或多導(dǎo)生理記錄儀記錄。確定心肌缺血以ST段抬高作為指標(biāo)，以ST段抬高≥2mv的點(diǎn)數(shù)(N—ST)代表心肌缺血的范圍，以各點(diǎn)段抬高的毫伏數(shù)之和(∑—ST)代表心肌缺血的程度。記錄阻斷冠脈血流前后的變化及藥物的影響。

缺血性心臟病藥PPT82(2)缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測定：在阻斷冠狀動(dòng)脈血流孔后，經(jīng)左心耳根部向心房注人碳索墨水1．5ml／kg，20-30s注完，迅速取下心臟，冰凍30—40min，在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線下．平行冠狀溝等厚度將心室部分橫切成5片，分別稱重，再用求積儀或電腦圖分析儀測量每片心肌兩面的墨水染色區(qū)與末染區(qū)(缺血區(qū))，計(jì)算心肌缺血范圍的重量及百分比。然后將5片心肌置硝基四氮唑藍(lán)(N—BT)染液中，震搖染色15min后取出，正常心肌染為暗藍(lán)色，梗死區(qū)心肌則小著色或淺黃色，用求積儀或落點(diǎn)求積法或電腦圖像分析法測量每片心肌兩面的梗死區(qū)和非梗死區(qū)，計(jì)算出每片心肌總面積、總重量；缺血區(qū)和梗死面積和重量；計(jì)算缺血區(qū)占心室百分比，梗死區(qū)占心空白分比，及梗死區(qū)占缺血區(qū)百分比，以評(píng)價(jià)藥物的療效。缺血性心臟病藥PPT82

(3)生化指標(biāo)：阻斷冠狀動(dòng)脈前后定時(shí)抽取血液，測量血中乳酸脫氫酶的變化，分析心肌損傷情況。為避免具他肌肉組織釋放的酶干擾，測同工酶。同時(shí)可測定血ATP、cAMP／cGMP、無機(jī)離子、代謝物、能量代謝物質(zhì)等，如需了解藥物作用與前列腺素的關(guān)系，可觀察PGl2或代謝產(chǎn)物的變化，以觀察藥物對的影響。如需了解藥物與氧自由基的關(guān)系，可測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)作為氧自由基產(chǎn)生和清除的觀測指標(biāo)。(4)血液流變性指標(biāo)測定：阻斷冠狀動(dòng)脈前后定時(shí)抽取血液，測定全血黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流變學(xué)指標(biāo)。缺血性心臟病藥PPT824注意點(diǎn)犬和小型豬是建立心肌缺血模型最常用的動(dòng)物，其體積大小適中，性情溫順、易訓(xùn)練、心臟解剖及生理特點(diǎn)與人相似，其影響因素有：(1)動(dòng)物冠狀動(dòng)脈分支及側(cè)支循環(huán)有個(gè)體差異，對分支及側(cè)支變異大的，不合標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)剔除不用，各組動(dòng)物模型心肌缺血程度和范圍接近。(2)正式實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)熟練掌握動(dòng)物開胸手術(shù)和冠狀動(dòng)脈分離手術(shù)，盡量減少出血，做心包床時(shí)，心肌不應(yīng)移位而影響心臟的正常舒縮功能。(3)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制心外膜電極的位置、壓力，心臟表面的溫度、濕度及位置。心外膜電極放置的位置，或反復(fù)測定的位置應(yīng)準(zhǔn)確固定，不應(yīng)移位。電極不可對心臟壓力過大，心臟表面的溫度及濕度應(yīng)穩(wěn)定，不可干燥。否則將影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。(4)實(shí)驗(yàn)可注射給藥，但口服中藥消化道給藥，消化道灌胃給藥或十二指腸給藥，灌胃時(shí)，注意動(dòng)物提前8—12h禁食。(5)在進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，排除干擾因素，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果。必要時(shí)同步測血氧、pH等。

缺血性心臟病藥PPT82(二)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死模型I，原理結(jié)扎大鼠的冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷其分布區(qū)域的心肌供血，心肌細(xì)胞長時(shí)間缺血缺氧而造成不可逆損傷和壞死。2．方法取體重200—250g雄性大鼠，乙醚吸入或戊巴比妥鈉腹腔麻醉，仰臥固定，氣管插管，在胸骨側(cè)作2cm的縱切口，近胸骨側(cè)剪斷第三第四肋軟骨，打開胸腔，聯(lián)接呼吸機(jī)(通氣量2ml／l00g，50次／min)。剪開心包膜，暴露心臟，冠狀動(dòng)脈左前降根部穿線以備結(jié)扎，記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖，穩(wěn)定10min，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，關(guān)閉胸腔，用針筒或橡皮吸引吸出動(dòng)物喉部分泌物，使動(dòng)物恢復(fù)呼吸。缺血性心臟病藥PPT823測定指標(biāo)(1)心電圖ST段及Q波標(biāo)測：記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖及胸前導(dǎo)聯(lián)心電圖，測∑—ST、病理性Q波、嚴(yán)重心律失常等指標(biāo)。(2)測定血漿生化指標(biāo)：如IDH、CPK、ATP、cAMP／cGMP、PGI2／TXA2等。(3)梗死面積估算：處死動(dòng)物，取心臟橫切數(shù)片，測梗死面積，方法同前，但誤差較大。可用石蚶包坤組織塊切片，染色，顯微鏡下觀測，分級(jí)定度或用定量組織學(xué)方法直接算心肌梗死面積。4．注意點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)方法在一般實(shí)驗(yàn)室條件均可進(jìn)行，方法簡便，但動(dòng)物較小，操作不便，耐受缺氧時(shí)間不長，心臟較小，實(shí)驗(yàn)誤差較大，可作為輔助試驗(yàn)。手術(shù)者必須熟悉冠狀動(dòng)脈的分布和解削位置，便于定位。操作者嚴(yán)格訓(xùn)練．操作熟練，手術(shù)時(shí)間不宜過長，部分結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后ECG無改變者需剔除。

缺血性心臟病藥PPT82(三)心肌缺血再灌注損傷模型1．原理心肌經(jīng)一定時(shí)間缺血(缺氧)后，突然恢復(fù)血(氧)供，形成更嚴(yán)重?fù)p傷，即“心肌缺血再灌注損傷”，其形成原因可能是心肌恢復(fù)血流時(shí)，加速細(xì)胞膜內(nèi)外的鈉鈣交換，大量鈣離子進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)，形成“鈣超載”：心肌細(xì)胞發(fā)生“拘縮”而喪失功能。心肌缺血再灌注損傷模型既可用于整體動(dòng)物，又能用于離體心臟和體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞。在藥效學(xué)研究可根據(jù)所試藥物的藥理作用及作用特點(diǎn)，選用不同的動(dòng)物和模型。2方法(1)在體心臟心肌缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)可用多種動(dòng)物如，犬、小型豬、貓和大鼠等。一般采用阻斷局部冠狀動(dòng)脈血流一定時(shí)間，然后恢復(fù)冠脈血流，形成再灌注損傷。手術(shù)方法觀察指標(biāo)大致同前。缺血性心臟病藥PPT82

(2)離體心臟缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)一般用成年Wistar種雄性大鼠，猛擊動(dòng)物頭部使昏迷，快速開胸，摘取心臟、立即放人4℃改良Krebs-Hensleit液中，主動(dòng)脈插管，裝于Leaigendorff罐流裝置，以K—H液(pH7．4)恒溫37℃進(jìn)行灌流。將兩電極分別于主動(dòng)脈及左心室壁，記錄心表面電圖。實(shí)驗(yàn)程序：①預(yù)備灌流期，心臟正常灌流(正常改良K—H液)，穩(wěn)定l0min，給藥灌流(含不同藥物的改良K-H液，實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行)5min。②缺血期，以00號(hào)線于左心耳部下力進(jìn)針，從肺動(dòng)脈圓錐旁穿出，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈10min。③復(fù)灌期，剪斷結(jié)扎線，進(jìn)行再灌注15min。

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3觀察指標(biāo)①心表面電圖，記錄復(fù)灌后5min出現(xiàn)的室性早搏PVC個(gè)數(shù)對數(shù)值lgPVC及室速與室顫總時(shí)對數(shù)值。②心肌丙醛(ADA)含量及越氧化物歧化酶(s0D)活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剪下再灌區(qū)全層心肌約0．2g，制備勻漿進(jìn)行測定。③心肌離子含量測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以無鈣沖洗液(三羥甲基氨基甲烷緩沖掖)沖洗心肌，取再灌區(qū)層心肌約o2g，干燥至恒重，以硝酸消化溶解，無離子水稀釋至所需濃度，原子吸收分光光度汁或等離子休發(fā)射光譜儀測定鈉，鉀、鈣，鎂等離子含量。心肌梗死面積測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將心臟橫切染色，計(jì)算心肌梗死面積。缺血性心臟病藥PPT82

(四)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血樣損傷模型1．原理通常應(yīng)用Wistar種大鼠乳鼠進(jìn)行原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)，用缺氧缺糖形成缺血樣損傷。心肌細(xì)胞缺氧缺糖后，功能從形態(tài)有明顯改變，如胞漿泡形成，胞漿顆粒增加出現(xiàn)異形心肌細(xì)胞等；經(jīng)活體染色證實(shí)細(xì)胞死亡數(shù)增加；搏動(dòng)頻率下降，動(dòng)作電位改變；胞漿的乳酸脫氫酶，羥酸脫氫酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用這些指標(biāo)評(píng)定藥物對心肌細(xì)胞缺血樣損傷的保護(hù)作用。缺血性心臟病藥PPT822．方法取出生2—3曰乳鼠，開胸、取心室，放人盛有Eagle培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗3次，三角燒瓶中用眼科剪將心室組織剪成碎塊，加入0．06％胰蛋白酶溶液。在攪拌器上37℃水浴消化10min．自然沉淀后，丟上消液，沉淀的組織塊再加入胰蛋白酶，消化l0min，然后吹打1min，自然沉淀，上清移人離心骨中。加入等量冷培養(yǎng)基以終止消化，離10min(2000r／min)，棄上清，再加入適量培養(yǎng)基于離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀中，混勻，離心，棄上清以洗殘存的胰蛋白酶，加入15％Eagle培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液。將自然沉淀的組織塊反復(fù)消化數(shù)次，直至完全分散為止。將各次消化制的細(xì)胞懸液集中，制成心肌細(xì)胞懸液，接種至玻璃培養(yǎng)瓶，塞緊，37c下靜置單層培養(yǎng)或在二氧化碳培養(yǎng)鞘開放培養(yǎng)。體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧缺糖性損傷模型的建立方法：取培養(yǎng)3日的心肌細(xì)胞，按下法進(jìn)行缺氧缺糖實(shí)驗(yàn)．①缺糖：實(shí)驗(yàn)時(shí)采用無糖液或不含糖的Eagle培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)。②缺氧：將無糖Hanks液或無糖培養(yǎng)基預(yù)先用純氮?dú)?99.999％)飽和15min；實(shí)驗(yàn)時(shí)換人這種缺氧缺糖液或培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶內(nèi)再充人氮?dú)?1l/min)30s．以置換瓶內(nèi)空氣，然后塞緊瓶塞。正常對照組用正常Hanks液或培養(yǎng)基，不充氮?dú)猓缬枚趸寂囵B(yǎng)箱加以培養(yǎng)，則通人95％N2+5％C02氣體形成缺氧。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧損傷，開觀察藥物對供氧損傷的影響。缺血性心臟病藥PPT82

3．測定指標(biāo)(1)形態(tài)學(xué)觀察：用臺(tái)盼蘭染色進(jìn)行死活細(xì)胞鑒定，觀察細(xì)胞活力的改變及死亡比例，光學(xué)顯微鏡下可觀測心肌細(xì)胞形態(tài)變化，如偽足變化、胞泡形成、胞漿顆粒增加、異形(長形、紡錘形)心肌細(xì)胞的出現(xiàn)。在掃描或透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。(2)心肌細(xì)胞搏動(dòng)的變化：包括搏動(dòng)的頻率、節(jié)律及強(qiáng)度等。(3)胞漿酶的釋放：可用生化或細(xì)胞化學(xué)方法測定缺氧缺糖后心肌細(xì)胞內(nèi)從培養(yǎng)基中酶的變化，如IDH、CPK、羥酸脫敏酶、轉(zhuǎn)氨酶等的變化。(4)其他：測定細(xì)胞內(nèi)氧化物歧化酶的變化從鈣離子運(yùn)轉(zhuǎn)等。上述觀測指標(biāo)綜合選用，以判斷心肌細(xì)胞損傷程度及藥物保護(hù)作用。缺血性心臟病藥PPT82

4．方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：①觀察藥物對心肌細(xì)胞的直接作用，可排除藥物通過其他間接影響心肌缺血氧的作用。②節(jié)約藥物，適用于分離或合成得到的極少藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。③適用于從細(xì)胞或分子水平進(jìn)行機(jī)制研究。局限性：①技術(shù)設(shè)備要求高。②不適于觀察不溶于水或含雜質(zhì)的粗制藥物，或非直接作用心肌細(xì)胞的藥物的作用。因此，本法應(yīng)與整體或器官水平的實(shí)驗(yàn)配合進(jìn)行，以便更全面的判斷藥效。缺血性心臟病藥PPT82(五)藥物誘發(fā)心肌缺血模型近年研究認(rèn)為冠狀動(dòng)脈痙攣是導(dǎo)致心肌急性缺血的主要原因之—．致心絞痛、心肌梗死和猝死。目前常用垂體后葉素在整體動(dòng)物(犬、小型豬、兔、豚鼠，大鼠)或離體心臟上造成冠脈痙攣心肌缺血模型，或用兒茶酚胺類藥物引起心肌缺血的方法，以評(píng)價(jià)抗心肌缺血藥物的療效。l、垂體后葉素誘發(fā)心肌缺血模型(1)原理：垂體后葉素能使冠狀動(dòng)脈痙攣，造成急性心肌供血不足，從外周阻力增加．導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，心電圖可見心肌缺血的典型變化，適用于緩解冠狀動(dòng)脈痙攣以防治心肌缺血藥物的初篩方法；垂體后葉素能收縮全身(特別是內(nèi)臟)小血管，作用是非特異的。缺血性心臟病藥PPT82(2)方法：大鼠缺血模型：取體重200g健康大鼠，腹腔注射烏拉坦麻醉，仰臥固定，將電極插入四肢及胸前心尖搏動(dòng)處皮下，調(diào)節(jié)心電圖靈敏度1mV=15mm，紙速為50mm/s，可璉接心電示波器連續(xù)觀察心電變化，記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或?qū)?lián)心電圖。實(shí)驗(yàn)前有心電圖或心律失常異常變化，則棄去不用，根據(jù)所試藥物特點(diǎn)選擇適當(dāng)給藥途徑和間隔，靜脈給后1—5min腹腔注射后15—30min，灌胃后1-2h，經(jīng)下靜脈或尾靜脈注射垂體后葉素0．5或0．7u／kg，注射速度5s或l0s。注射后即刻、5s、10s、15s及30s、lmin、2min及5min，重復(fù)記錄心電圖(記錄時(shí)間可據(jù)示波器所示異常情況決定)。正常大鼠注射腦垂體后葉素后心電圖變化分兩期：第一期，注射即刻至30s，T波升高，ST段抬高(超過o．1mV)，尤以l0s變化最明顯。第二期，注射后30s至數(shù)分鐘，T波低．雙相、倒置，心率變慢，P—R及Q—T間期延長。判定標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)第一期或第二期缺血變化為陽性，否則為陰性，比較各組的差異，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

缺血性心臟病藥PPT82家兔缺血模型：健康家兔，體重2—3kg，在清醒或麻醉狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或D導(dǎo)聯(lián)心電圖，耳靜脈30s注入垂休后葉素2．5u／kg，心肌缺血的心電變化急劇，不便判斷藥效，亦可改用靜脈滴注法，即在l0min內(nèi)恒速滴人上述劑量的垂體后葉素，心電圖變化可持續(xù)到15—30min，除上述缺血性心電圖變化外，偶有竇性心律失常、室性早搏、室性心動(dòng)過速等心律失常發(fā)生。判定指標(biāo)同大鼠。缺血性心臟病藥PPT82

2，異丙腎上腺素誘發(fā)心肌缺血模型(1)原理：異丙腎上腺素為受體興奮劑．通過加快心率增加心肌收縮力等環(huán)節(jié)，增加心肌耗氧量，造成心臟負(fù)荷過重，心肌微循環(huán)障礙，連續(xù)應(yīng)用可形成心肌損傷，可用心電圖和病理方法觀測病變程度。適用調(diào)節(jié)心肌代謝、氧供需平衡及作用于受體藥物的研究；(2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓或犬均可。經(jīng)心電圖檢查，棄去心電圖有異常改變或心律失常。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射異丙腎上腺素2—8mg／kg，家兔10—16mg/kg連續(xù)兩日，第一次和第二次紿異丙腎上腺素后30min內(nèi)，每隔5min記錄心電圖一次，第二次給藥后24h記錄心電圖后殺死動(dòng)物，取心臟做病理切片檢查。缺血性心臟病藥PPT82異丙腎上腺素可引起T波倒置或雙相，有ST段抬高，竇性心動(dòng)過速(心率明顯加快)，早搏或伴有其他心律失常。心肌病理觀察可見：白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，心肌纖維腫脹、斷裂、橫紋消失、甚至溶解，發(fā)生玻璃樣變和脂肪變性等。比較各心電圖和病理變化，以判斷藥效。(3)注意點(diǎn)：適用于研究影響心肌氧代謝平衡或作用受體而防治心肌缺血的藥物，用心電圖難于定量觀測藥物的作用，須用病理觀測，但制備病理標(biāo)本及觀察量較大，難準(zhǔn)確定量，是其缺點(diǎn)，可用分級(jí)定度或半定量法觀測。缺血性心臟病藥PPT82

3．麥角新堿誘發(fā)心肌缺血模型(1)原理：動(dòng)物左冠狀動(dòng)脈干注入麥角新堿，可誘發(fā)明顯的冠狀動(dòng)脈痙攣和血流動(dòng)力學(xué)改變：平均動(dòng)脈壓、冠脈壓和肺動(dòng)脈壓及外周阻力增加，心排出量下降，乙電圖ST-T抬高，60％發(fā)生室性心律失常，左冠狀動(dòng)脈造影顯示狹窄率達(dá)50％—75％，動(dòng)脈血氧下降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺環(huán)素下降，顯示急性心肌缺血缺氧全身高凝狀態(tài)的病理生理改變：、病理學(xué)證實(shí)，心肌有缺血壞死性改變及冠脈血栓形成。這種動(dòng)物模型可用以評(píng)價(jià)通過緩解冠狀動(dòng)脈痙攣、攻善血液流變性等多種途徑．防治心肌缺血的藥物。(2)方法：健康犬，體重lo—20kg，戊巴比妥鈉30mg／kg注射麻酢，自右側(cè)股動(dòng)脈插入導(dǎo)管至左冠脈主干，以麥角新堿o.22mg／kg于生理鹽水，lmin內(nèi)拄入，可形成冠脈痙攣及心肌缺血。(3)觀測指標(biāo)：心電圖或體表標(biāo)測心電圖∑—ST及N—ST改變。血流動(dòng)力學(xué)改變。生化指標(biāo)：CPK、血小板聚集、TXB2、kelo—PGF等變化。心臟病理學(xué)改變。(4)注意事項(xiàng)：本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)是不開胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，通過心電圖、血流動(dòng)力學(xué)、生化和病理研究以評(píng)價(jià)抗心肌缺血藥的治療作用。但設(shè)備及技術(shù)要求較高，如血流動(dòng)力學(xué)的測定需要帶熱敏電阻的Swan-Gmlg四腔導(dǎo)管等。為簡化實(shí)驗(yàn)方法，可試用貓、兔、大鼠或豚鼠按照垂體后葉素實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。缺血性心臟病藥PPT82(六)心臟血流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)1．原理心肌缺血往往伴隨心臟血流動(dòng)力學(xué)改變，人部分治療缺血性心臟病的有效藥物均可改善血流動(dòng)力學(xué)而發(fā)揮作用。因此，心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)應(yīng)作為主要藥效學(xué)研究內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可用犬、小型楮、貓或大鼠，但后兩種動(dòng)物心臟較小，某些指標(biāo)不宜直接觀測，犬和小型豬應(yīng)作為首選動(dòng)物。2．方法健康犬或小型堵，雌雄兼用，體重12-15kg實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用戊巴比妥鈉(30mg／kg)靜脈麻酐，手術(shù)臺(tái)固定，分離氣管并插管，連接電動(dòng)呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量300—600ml，動(dòng)脈氧分壓維持在如—100mmHg，血ph在正常范圍；左側(cè)第四肋開胸，露心臟，剪開心包，做心包床：分離冠狀動(dòng)脈左旋及主動(dòng)脈根部。放置相應(yīng)直徑電磁量計(jì)探頭，分別測量冠脈血流量及心出量。左心室尖部插管，連接壓力換能器，測定左室內(nèi)壓，再經(jīng)微分惻定左室內(nèi)壓上升最大速率。頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇，動(dòng)脈插管，以血氧測定儀或血?dú)夥治鰞x分別測定冠狀靜脈血氧含量及動(dòng)脈血氧含量，計(jì)算心肌耗氧量。股動(dòng)脈插管測定動(dòng)脈血壓，以肢體導(dǎo)聯(lián)觀測標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)心電圖并計(jì)算心率。公式算其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：心搏出量、耗氧指數(shù)、心臟指數(shù)、冠脈阻力外周阻力及氧利用率等。將上述各項(xiàng)指標(biāo)同步錄于多道生理記錄儀。3.注意點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)難度較大，耍具備成套精密儀器。、實(shí)驗(yàn)人員要經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練，盡量減少對心肌功能的影響。分離主動(dòng)脈根部、冠狀動(dòng)脈及相應(yīng)電磁換能器、心尖部插管等是手術(shù)成功的關(guān)鍵。

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(七)冠脈循環(huán)實(shí)驗(yàn)1．原理冠脈流量是評(píng)價(jià)防治心肌缺血藥物的重要指標(biāo)。多年來，國內(nèi)外對擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的藥物進(jìn)行廣泛、系統(tǒng)、深入的研究：，雖然能增加冠脈血流量的藥物很多，但不一定都有防治心肌缺血的作用。研究中，應(yīng)以多種指標(biāo)綜合分析，了解平衡兩方面的變化，特別是凈效應(yīng)，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)論。冠脈流量測定分兩種：即整體冠脈流量的測定和離體冠脈流量的測定。為了解藥物對缺血區(qū)心肌實(shí)際供血情況，可在整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行冠脈側(cè)支循環(huán)、心肌區(qū)域血流量、心肌營養(yǎng)血流的研究，從不同角度反映藥物對冠脈循環(huán)的影響及防治心肌缺血的療效。缺血性心臟病藥PPT822．方法(1)犬冠脈循環(huán)實(shí)驗(yàn)法：冠脈血流量測定，手術(shù)方法與步驟同心臟血流動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開胸完成后，分離冠狀動(dòng)脈左旋支，放置適宜電磁流量探頭，測量冠脈血流量．測定動(dòng)脈血壓。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下心臟稱重，以1／3心重作為冠脈旋支血流供血區(qū)域，計(jì)算每100g心肌每lmin血流量。冠脈側(cè)支循環(huán)研究方法：實(shí)驗(yàn)用健康成年犬，手術(shù)同前，開胸手術(shù)完成后，分離上動(dòng)脈根部。放相應(yīng)直徑電磁流量計(jì)探頭．測量心輸出量。在冠脈左前降支下1／3處，分離并結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，于遠(yuǎn)端插入冠脈插管。分離頸總動(dòng)脈插管，與冠脈插管相連形成旁路，灌注前降支遠(yuǎn)端。三通的第三臂接橡皮臂，以收集反流量，測量反流壓。插前，靜脈注入肝素750u／kg。分離股動(dòng)脈，插入動(dòng)脈管，記錄動(dòng)脈血壓。實(shí)驗(yàn)開始，阻斷須總動(dòng)脈向冠脈左前支的灌流。停灌后10min，分別記錄心輸出量、冠脈反流量及反流壓，動(dòng)脈壓及心率，作為給藥前對照值，然后給予實(shí)驗(yàn)藥物。給藥后不同時(shí)間，分別紀(jì)錄各值，反流量推算單位壓力差下冠脈惻支血管流量(CVC)=反流量／動(dòng)脈舒張壓，以此反映側(cè)支血流阻力變化。缺血性心臟病藥PPT82(2)冠狀靜脈竇血流量測定：通過測量冠狀靜脈竇血流量，反映冠脈血流量的變化，約60％的冠脈血經(jīng)冠脈竇流入右心房。利用冠狀靜脈竇插管直接抽血測定血氧含量，計(jì)算出心肌耗氧量及氧攝取率。注意事項(xiàng)：本法研究藥物對犬或貓的冠狀靜脈竇流出量、心肌耗氧量的影響，簡單方便，作為初篩抗心絞痛藥物，能從供血與耗氧兩力面來評(píng)價(jià)。缺血性心臟病藥PPT82(3)Rb測定心肌營養(yǎng)血流量：冠脈血流除了通過毛細(xì)血管為心肌提供營養(yǎng)性血流外，一部分血流經(jīng)動(dòng)—靜脈吻合支分流人靜脈，兩者構(gòu)成冠脈總血流量。為尋找治療冠心病藥物，觀測心肌營養(yǎng)性血流量及冠脈總血流兩者配合更有意義。銣與鉀為同族元素，理化性質(zhì)相似，均可通過血流進(jìn)入心肌胞，血流越大，撮取量越多。Rb半衰期為19．5日，易于測定，對心肌有特殊的親和力，攝取量為骨骼肌的2，5倍，故適用于測定心肌營養(yǎng)血流量。方法：取體重24g的健康小鼠分組，給藥或?qū)φ账幒蟾粢欢〞r(shí)間，根據(jù)待試藥物的藥代動(dòng)力學(xué)過程確定，從尾靜脈注射RbCl生理鹽水溶液o．1ml(4000—10000脈沖／min)，5s注入，注射后30s，立即處死動(dòng)物，取心臟，用生理鹽水沖洗4次，每次l0ml。然后將心臟置玻璃研缽內(nèi)．磨成勻漿，放特制鋁箔小皿內(nèi)，在普通燈下烘干，用射線自動(dòng)標(biāo)器計(jì)數(shù)。以每個(gè)心臟放射性占注入總放射性的分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，觀察小鼠心肌攝取Rb量的多少。注意：①為防污染，全部操作在盤內(nèi)進(jìn)行．實(shí)驗(yàn)后一并處理。②Rb量及動(dòng)物處死時(shí)間要準(zhǔn)確，井將心臟的動(dòng)靜脈全部剪掉。③每只動(dòng)物取心臟時(shí)所用剪刀、鑷子齊用—套．以防不同動(dòng)物間相干擾。缺血性心臟病藥PPT82

(4)心肌區(qū)域血流量測定：放射微粒法測定心肌區(qū)域血流量的原理是利用放射性素標(biāo)記的微粒注入左心房，循環(huán)的微粒幾乎全部組織固定，故微粒流人每個(gè)器官的量(以放射性表示)與該器官血流成正比。區(qū)域性心肌血流量的操作方法是用羰化塑料微球懸于含o．01％吐慍80的生理鹽水內(nèi)，使用的置旋渦混合器I—2min，取微球500萬，用生理鹽水稀釋到l0ml，10s內(nèi)注入麻醉開胸犬左房導(dǎo)管，再用10ml鹽水沖洗導(dǎo)管：注射微球的同時(shí)用恒速泵以6-7ml／min的速度從插人動(dòng)脈弓的導(dǎo)管連續(xù)取3份參考樣品，每份40s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取出心，剔除表面的脂肪、血管與心瓣膜，將左窒壁切割成每份重1～2g的組織塊，每塊分成內(nèi)膜下、中間與外膜下心肌層。用多導(dǎo)Y能諾分析儀記心肌與參考血樣品的放射。汁算心肌區(qū)域性血流量。根據(jù)阻斷冠脈前后心肌組織內(nèi)血流量的變化．減少25％以上者為缺血，減少大于75％者為嚴(yán)重缺血區(qū)。用以研究藥物對心肌缺血時(shí)不同部位，不問層次的心肌血流量的影響。缺血性心臟病藥PPT82(5)離體心臟冠脈灌流法：哺乳動(dòng)物離體心臟，插管人動(dòng)脈灌流肘，灌流液須經(jīng)冠狀動(dòng)脈經(jīng)右心房流出心臟，故流出量可代表冠脈流量，在灌注壓不變的條件下，其流量可反映冠脈阻力的變化。方法：雄性大鼠，體重200-250g，腹腔注射0．6％戊巴比罷鈉45mg／kg麻醉．仰位固定，分離—側(cè)股靜脈，注入肝素125u，剪開胸．暴露心臟，動(dòng)脈第—支頭臂動(dòng)脈發(fā)出處近端橫斷，速將心臟投入4C灌流液，沖洗冠狀動(dòng)脈中的殘留血液，將心臟移至lallgendoff灌流裝置F端，以Krebs—Henseleit液灌流。待心臟跳動(dòng)規(guī)則后，在肺動(dòng)脈起始處剪一小口，以利冠狀血回流液排出。心臟表面放置鉑電極，連接電刺激，用于心臟起搏。灌注約15rain后，連續(xù)測定每分鐘冠脈流量3次：待恒定后開始給藥，／H量筒收集流出記錄給藥前后及給藥后每lmin流出量。同叫可測定心肌耗氧星及其他生化指標(biāo)的變化。

缺血性心臟病藥PPT82注意事項(xiàng)：藥物的pH及無機(jī)離子含量血接近生理值，否則酸性藥液可增加冠脈流量，須用與藥物同樣pH及無機(jī)離子的對照劑。實(shí)驗(yàn)中供氧，溫度、灌流壓力及灌液PH要固定不變。灌流液必須用新鮮蒸餾水臨時(shí)配制。冠脈血管阻力受血管張力影響，受心肌緊張度對心血管支持力的影響。藥物抑制心肌收縮力，可使血管阻力降低．冠脈流量增加，假陽性。為排除這種影響，可先心臟纖顫，然后觀察約物對冠脈流量的影響。用6V直流電產(chǎn)生的斷續(xù)感應(yīng)電震直接刺激心臟，或用方形波刺激器刺激，也用交流電刺激引起心纖顫，然后測定每lmin冠脈流量的變化。缺血性心臟病藥PPT82(八)心肌氧代謝實(shí)驗(yàn)在心肌代謝中，氧的供需占有重要地位，供氧不足，耗氧增加是缺血性心臟病的主要矛盾。左心室心肌耗氧量為每分鐘8—10ml／100g(心肌)，工作負(fù)荷增加時(shí)每分鐘可達(dá)40ml／100g(心肌)。停心肌供氧，經(jīng)3次收縮即出現(xiàn)缺氧，因此，心肌耗氧測定是研究防治冠心病藥物的重要指標(biāo)。心肌氧代謝的研究方法約分為三類。缺血性心臟病藥PPT821．直接測定①心肌耗氧星測定，在電磁流量汁測定冠脈血鼓的同叫反復(fù)多次測定動(dòng)脈血及冠狀靜脈竇血氧量?？捎?jì)算心肌耗氧。②心肌氧張力測定，極譜儀的鉑電極插入丌胸犬的心肌，連續(xù)紀(jì)錄心肌氧張力的變化。心肌缺血時(shí)內(nèi)膜下血流及氧張力下降甚于心外股，缺血什損傷及壞死也較外層心肌嚴(yán)重，因此，用雙暴露電極測定左心室外／內(nèi)膜下氧張力變化以研究藥物的影響，更有意義。能選擇性增加心膜下氧張力的藥物或措施，對缺血性心肌都有保護(hù)作用。這方法儀器昂貴，國內(nèi)尚未廣泛應(yīng)用，③離體心臟心肌片或心肌組織及體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞耗氧量測定，離體心臟灌流，分別測定流人液及流小液的含量，可算出心肌耗氧。或用瓦氏呼吸器測定心肌的耗氧量。或測氧儀直接測定心肌片的耗氧量。方法簡便，結(jié)果穩(wěn)定。缺血性心臟病藥PPT822間接測定①張力—時(shí)間指數(shù)，根據(jù)心肌耗氧量與心臟做功有密切關(guān)系的原理，間接推測心肌耗氧量的變化。②心肌耗氧指數(shù)，根據(jù)左心室需氧量決定于心率及收縮壓的原理，間接推算心肌耗氧量的變化。③正性肌力作用，心肌收縮力、心肌縮短速度與心肌耗氧呈線形關(guān)系，凡有正性肌力作用或延長射血時(shí)間者，均增加心肌耗氧量，可根據(jù)藥物指標(biāo)的影響推測心肌耗氧量的變化。缺血性心臟病藥PPT82

3心肌耐缺氧實(shí)驗(yàn)增加心肌供血(供氧)或減少能量(氧)消耗，維持能量<氧)代謝平衡，可提高心肌耐缺氧能力，國內(nèi)常用耐缺氧實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)—些藥物的作用。①離體心臟灌流耐缺氧實(shí)驗(yàn)，用不同程度的低氧或無氧流液灌流離體心臟，觀察心臟功能、形態(tài)及生化指標(biāo)的變化，可反映離體心臟對不同缺氧程度的耐受能力以及藥物的影響，并可用于受體作用的研究，但易受體外環(huán)境的影響，須嚴(yán)格擰制實(shí)驗(yàn)條件。②大鼠心肺灌流耐缺氧實(shí)驗(yàn)，此法除可反映離體心臟的耐缺氧能力和藥物作用外，可同時(shí)測定血壓、心輸出、心房壓及靜脈壓等各項(xiàng)指標(biāo)，說明這些因素與心肌耐缺氧之間的關(guān)系以及藥物的作用。實(shí)驗(yàn)方法較前者復(fù)雜，但可獲得較多信息，對藥物研究有—定實(shí)用價(jià)值。③體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞耐缺氧實(shí)驗(yàn)，利用體外的人或動(dòng)物心肌細(xì)胞，模擬臨床缺血性心臟病形成缺氧缺糖性損傷的細(xì)胞病理模型，用于研究藥物對心肌細(xì)胞缺氧能力的影響．與前述方法結(jié)合。可從器官、組織及細(xì)胞水平反映藥物對心肌耐缺氧能力的影響。④其他，小鼠常壓或減壓缺氧實(shí)驗(yàn)，方法簡單，應(yīng)用廣，反映整體(特別是腦組織)的耐缺氧能力，但特異性差，不能反映心肌的耐缺氧力，易受鎮(zhèn)靜、催眠或刺激性藥物的影響，出現(xiàn)假陽性。用小鼠或大鼠測定速度、存活時(shí)間及死亡時(shí)余存氧含量，可以較準(zhǔn)確的反映出整體動(dòng)物的耗氧速度及藥物的影響，較前者精細(xì)，但亦不能直接說明心肌的耐氧能力，耗氧速度。缺血性心臟病藥PPT824，其他心肌代謝除氧的攝取利用外，尚包括碳水化合物，脂肪、蛋白質(zhì)等方面。深入研究藥物對這方面的影響，是必要的。酶學(xué)研究．如磷酸肌酸酶(CPK)可以定量地反映心肌損傷的程度，乳酸脫氧酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等，也常用以反映心肌損傷度。測定動(dòng)脈血，冠狀靜脈或缺血區(qū)血液乳酸或鉀的含量，較心電圖及血流動(dòng)力學(xué)更敏感的反映心肌缺氧程度及藥物的影響。兩者升高說明心肌缺氧。下面重點(diǎn)介紹幾種常用方法。缺血性心臟病藥PPT82

(1)心肌耗氧量直接測定法：經(jīng)冠狀靜脈竇和頸總動(dòng)脈插管，抽取冠狀靜脈和頸總動(dòng)脈血，以血氧測定儀或血?dú)夥治鰞x直接測定血氧含量算心肌耗氧量?？膳c實(shí)驗(yàn)中同時(shí)測定的其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)如冠脈血流量、血壓、心電圖等連續(xù)描記于生理記錄儀，進(jìn)行比較研究。方法：健康成年犬，戊巴比妥鈉(30mg／kg)靜脈麻醉．開胸手術(shù)同前，從頸外靜脈插冠狀靜脈竇，同時(shí)頸總動(dòng)脈插管。藥前及藥后不同時(shí)間抽取血樣進(jìn)行血氧測定，與其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)同時(shí)紀(jì)錄相比較。注意事項(xiàng)：熟練掌握冠狀靜脈竇插管技術(shù)，保持導(dǎo)管在冠狀靜脈竇內(nèi)正確位，以保證血流通暢。取血量要適度，避免抽取血量過多而造成缺血。缺血性心臟病藥PPT82(2)氧電極測定心肌耗氧率的方法：氧電極怯測定系利用氧在極化電壓下溶解的氧被還原而產(chǎn)生電流。所以當(dāng)測定系統(tǒng)將電極與被測溶液用能通過氣體分子的聚乙烯薄膜隔開后，在一定極化電壓下電極中測的電流量將只反映破測系統(tǒng)彌散過來的氧，故與被測溶液中的氧分壓成正比，與組織的耗氧成反比，從而可以反映組織的代謝活動(dòng)。方法：大鼠或家兔隨機(jī)分組，給藥或?qū)φ找汉螅謩e測定心肌耗氧量或結(jié)扎冠狀動(dòng)脈形成心肌缺血。再經(jīng)—定時(shí)間后處死動(dòng)物，取心肌梗死區(qū)及對照區(qū)心肌組織，于冰浴上切、稱重，加入心肌孵液，于37℃恒溫水浴平衡，然后將孵育液注入測氧儀，測氧分壓，孵育前后的氧分壓差值即為該組織的耗氧值。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每份樣本檢測2～3次，取其均值。注意事項(xiàng)：本法為整體實(shí)驗(yàn)，離體測定，可對正常心臟或缺血心臟進(jìn)行不同部位的心肌耗氧量測定，反映藥物對正常及缺血心肌耗氧的影響，方法簡便，快速、易普及，但影響因素較多，嘛醉、呼吸狀態(tài)及供氧情況，心肌標(biāo)本的處理從測氧條件的控制，儀器的穩(wěn)定性與靈敏以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度的變化等，均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果作用。

缺血性心臟病藥PPT82(3)非特異性方法：小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)法方法：將lo個(gè)250ml或500ml的磨口廣口瓶放入鈉石灰10g，上墊濾紙。然后每瓶放人一只小鼠，各組動(dòng)物分別給生理鹽水或藥物。將小鼠放入瓶后，將徐有凡士林的瓶蓋蓋緊，記錄時(shí)間，觀察各組動(dòng)物存活時(shí)間。可用玻璃干燥器代替廣口瓶。用紙板隔為小格，每格放入小鼠一只，干燥器內(nèi)放入一定量的鈉灰或氫氧化鈉氯化鈣等量，用以吸收水分和二氧化碳?；蛴醚b有氧電極的橡皮塞塞緊瓶，使氧電極與瓶內(nèi)氣體接觸，連接測氧儀，可測出瓶內(nèi)氧量變化，反映耗氧速度。注意事項(xiàng)：此法特異性較差，大腦比心肌對缺氧更為敏感，很多有中樞抑制的藥物或刺激性約物腹腔注入可減少動(dòng)物活動(dòng)，降低機(jī)體耗氧量，也能延長存活時(shí)間，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。(4)小鼠低壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)法，本法與常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)法相似，但將小鼠放入密封的低壓容器內(nèi)。缺血性心臟病藥PPT82厥脫證藥缺血性心臟病藥PPT82一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)厥脫證是指邪毒內(nèi)陷或內(nèi)傷臟氣、氣陰耗竭或亡津失血所致的氣血逆亂，正氣耗脫的一類癥證。厥證是指邪熱內(nèi)陷或陰寒內(nèi)盛所致的四肢逆冷病證。脫證為陰陽氣血衰竭的危重證候，厥證由輕轉(zhuǎn)重致脫，脫證早期可為厥，厥脫不同于單純的厥證或脫證，是由厥至脫，厥脫并見的臨床綜合病證，以手足厥冷，大汗淋漓，脈微欲絕，神志煩躁，淡漠或昏迷為臨床表現(xiàn)。臨床厥脫證已有較明確的辨證指標(biāo)和治療準(zhǔn)則。厥脫證分為寒厥證、熱厥證、陰脫證，陽脫證、氣血兩脫和陰陽俱脫證等。厥脫各證互相轉(zhuǎn)化，熱厥證外感溫?zé)岵?，熱毒?nèi)陷．高熱致厥，進(jìn)一步發(fā)展，熱毒熾盛、內(nèi)攻臟腑、陰液大耗而致陰脫證，也可熱傷氣陰，陰陽離決，陽氣暴脫而致陽脫證。陽脫證治療以回陽救逆固脫為主；陰脫征治療以益氣養(yǎng)陰固脫為主。根據(jù)辨證原則，可分為氣陰兩虧，陽氣暴脫，真陰耗竭，熱毒熾盛，心氣不足，氣滯血瘀等六型，各型之間可以互相挾雜。厥脫證的臨床表現(xiàn)相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的各種休克和循環(huán)衰竭。引起的原因多種．如久血性、感染性、心源性、創(chuàng)傷性，過敏嚴(yán)重性休克等。休克是一種急性循環(huán)功能不全綜合征，是有效血液循環(huán)不足，使全身組織和重要臟器的血液灌注不足，導(dǎo)致組織缺血缺氧，微循環(huán)淤滯，代謝索亂和臟器功能障礙等一系列改變。缺血性心臟病藥PPT82二、藥效學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(一)對厥脫證動(dòng)物模型的治療作用試驗(yàn)1．常用動(dòng)物模型(1)失血性休克模型：用動(dòng)脈急性放血的方法，急性失血達(dá)總血量的15％—20％時(shí)，就發(fā)生休克，待血壓降至5．3kPa時(shí)便達(dá)到難逆性克?？蛇x犬、貓進(jìn)行試驗(yàn)，大鼠及兔較差。(2)感染性休克模型：用活菌、內(nèi)毒素或膿毒病灶復(fù)制感染性休克模型，可選用小鼠、大鼠，兔、貓，犬等。(3)心源性休克模型：用理化等有害刺激，損傷心肌，造成局部心肌壞死；結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的主要分支，造成心肌缺血性梗死；將塑料微球注入到冠狀動(dòng)脈內(nèi)，造成冠狀功脈栓塞；在心導(dǎo)管上附上不銹鋼電極，插入到冠狀動(dòng)脈，通以弱電流，造成冠狀動(dòng)脈血栓及心肌缺血性栓塞等造成心源性休克動(dòng)物模型?？蛇x用犬、貓、小型豬等。缺血性心臟病藥PPT82

(4)創(chuàng)傷性休克模型：用止血帶造成動(dòng)物肢體缺血引起創(chuàng)傷性休克；反復(fù)錘動(dòng)物腿部肌肉；用木板及鉗持續(xù)擠壓動(dòng)物腿；牽扯腸襻；損傷胸腔器官等均可引起創(chuàng)傷休克。常用動(dòng)物有小鼠、兔、貓等。(5)過敏性休克模型：用抗原物質(zhì)致敏動(dòng)物后，注入相同的抗原，就可引起急劇的休克反應(yīng)。最常用的動(dòng)物是豚鼠，其次是兔、大鼠、小鼠，犬等。(6)腸系膜上動(dòng)脈夾閉性休克模型：夾閉腸系膜上動(dòng)脈，引起腸道缺血，當(dāng)一段時(shí)間后，恢復(fù)血液供應(yīng)，此時(shí)即引起休克。可選大鼠、免等。(7)其他類型休克：燒傷、疼痛、胰島素休克、微循環(huán)障礙、彌漫性血管內(nèi)凝血等動(dòng)物模型，亦可適當(dāng)選用。2觀察指標(biāo)(1)模型動(dòng)物死亡率：小動(dòng)物休克模型以休克動(dòng)物死亡率的影響評(píng)價(jià)有效性。(2)相關(guān)指標(biāo)：如與休克病理性情況改善相關(guān)的血流動(dòng)力學(xué)和血液生化學(xué)等。缺血性心臟病藥PPT82

3．方法學(xué)評(píng)價(jià)上述各種方法造成的模型，可根據(jù)新藥的主治和功效選。陽脫證臨床上以神志淡漠、面色蒼白，四肢厥冷，冷汗淋漓為主證，兼息微唇紺，脈微欲絕或不能觸及，血壓下降，尿少，與臨床“陽脫證”的表現(xiàn)相近似的動(dòng)物模型如：感染性休克晚期、失血休克晚期及心源性休克模型等。氣血兩脫，由急性失血引起，即失血亡陰之脫證，用失血性休克代償期和失代償早期作為氣血兩脫證的動(dòng)物模型，如為失代償晚期，屬陰陽俱脫證。陰脫證與感染休克脫水癥狀相似，可用腸道致病菌感染動(dòng)物，造成嚴(yán)重泄瀉，脫水；亦可用內(nèi)毒素或膿毒病灶引發(fā)休克，燒(燙)傷性休克動(dòng)物亦可作為陰脫型模型。缺血性心臟病藥PPT82(二)其他試驗(yàn)1.血壓及微循環(huán)因?yàn)殛柮撟C(亡陽)和陰脫證(亡陰)，均血壓和微循環(huán)異常，必須進(jìn)行血壓從微循環(huán)的觀察。2.血流動(dòng)力學(xué)、心功能及重要內(nèi)臟血流量藥物對整體動(dòng)物血流動(dòng)力學(xué)和心功能以及對心、腦、腎等重要內(nèi)臟血流量的影響，關(guān)系到藥效作用，應(yīng)進(jìn)行這方面試驗(yàn)。3．根據(jù)不同休克動(dòng)物模型，增加有關(guān)病因的試驗(yàn)(1)治療邪毒內(nèi)陷之脫證的藥物：除進(jìn)行上述有關(guān)休克模型外，還做①祛邪相關(guān)的試驗(yàn)，如抑苗、抗病毒、對抗毒索、抗炎、解熱等試驗(yàn)。②扶下相關(guān)的試驗(yàn)，如抗應(yīng)激能力試驗(yàn)、免疫功能試驗(yàn)、物質(zhì)代謝試驗(yàn)及內(nèi)分泌功能試驗(yàn)等。(2)治療心氣十足的藥物：可增加心功能衰竭模型、心功能測定及血流動(dòng)力學(xué)等有關(guān)試驗(yàn)。(3)治療與氣脫類似的過敏性休克藥物：或增加過敏試驗(yàn)等內(nèi)容。(4)治療劇烈疼痛致脫的藥物：可增加鎮(zhèn)痛等試驗(yàn)。4．其他還有重要臟器血流量如腦、腎及冠狀動(dòng)脈血流量的測定、自由基測定及各種酶的測定、電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察等對闡明厥脫證藥物的機(jī)制是必需的。缺血性心臟病藥PPT82

(三)陽性對照藥陽脫證治療以回陽救逆固脫為上，可用參附湯、四逆湯、參附注射液、參附青注射液等作對照；陰脫證治療以益氣養(yǎng)陰固脫為主，如生脈散、參麥散、生脈注射液、茶麥注射液等作對照。也可用多巴胺等作對照。

三、動(dòng)物模型建立方法(一)厥脫癥失血性休克模型1．原理以動(dòng)脈急性放血、急性失血達(dá)血量的15％-20％時(shí)，就可發(fā)生休克，待血壓降至5．3kPa(40mmHg)時(shí)便達(dá)到休克。缺血性心臟病藥PPT82

2操作方法將麻醉貓股動(dòng)脈插管并連接儲(chǔ)血瓶供放血和儲(chǔ)血用，用肝素鈉10mg／kg抗凝，開始放血每分鐘為2ml，當(dāng)血壓低于10kPa，改為分鐘O．5ml，放血使血壓降至5．3kPa，此時(shí)為失血代償期。如血壓下降，抬高儲(chǔ)血瓶回輸出血液，待儲(chǔ)血瓶內(nèi)最大放血量的40％的血液自動(dòng)回輸機(jī)體時(shí)作為失代償朋，總放血量為20—30ml／kg，此時(shí)再將全部放出的血液輸回機(jī)體，同時(shí)靜脈注射試驗(yàn)給藥，對照組以等量生理鹽水靜脈滴人。陽性藥組以多巴胺進(jìn)行比較。觀察血壓、呼吸、心電圖、最大放血量、存活率等。3．造模成功指標(biāo)和藥物療效觀察放血使血壓降至5.3kPa(40mmHg)，此時(shí)為失血代償期，此時(shí)給予治療厥脫證新藥，同時(shí)輸血液，血壓可回升，動(dòng)物可存活。4注意點(diǎn)(1)放血速度不宜過快，否則會(huì)突然死亡。(2)如動(dòng)物進(jìn)入失代償期晚期，此時(shí)將全部放出的血液輸回機(jī)體，仍有95％-98％動(dòng)物死亡。缺血性心臟病藥PPT82(二)感染性休克模型1．原理內(nèi)毒素是細(xì)菌重要的致病因子之一，在微量時(shí)引起發(fā)熱，大量進(jìn)入血液則引起循環(huán)衰竭造成厥脫證而致死亡。2．操作方法用大腸桿菌內(nèi)毒素或內(nèi)毒素靜脈注射造成感染性中毒性休克，可用小鼠、大鼠、兔、貓、犬等。麻醉犬靜脈注射大腸內(nèi)毒素，觀察中毒性休克血流動(dòng)學(xué)的變化和抗休克作用，亦可進(jìn)行血液生化及酶學(xué)指標(biāo)觀察。3．造模成功的指標(biāo)和藥物療效觀察內(nèi)毒素注射初期，DAP，MAP，指標(biāo)下降迅速。15min時(shí)，各指標(biāo)有不同程度回升，60min后，冉度出現(xiàn)降低，維持在休克時(shí)的水平．藥效根據(jù)給藥后上述指標(biāo)情況，觀察給藥后2h內(nèi)，2h從3h后，外周血壓指標(biāo)情況，應(yīng)與對照組有顯著差異。

缺血性心臟病藥PPT824．注意點(diǎn)(1)實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌內(nèi)毒素可由干燥大腸艾希菌制備，經(jīng)毒力測定后封裝在安缽內(nèi)，保存?zhèn)溆?。?xì)菌內(nèi)毒素種類很多，常用的大腸桿菌、鼠傷寒桿菌、各種痢疾桿菌、馬流產(chǎn)桿菌等制配方法、純度及動(dòng)物敏感性不同，其毒力不同，如鼠傷寒桿菌內(nèi)毒素對小鼠的LD50為3mg／kg左右，而黏質(zhì)沙雷桿菌者達(dá)35mg／kg。實(shí)驗(yàn)前必須測定所選內(nèi)毒素對所用品系動(dòng)物的毒力。(2)自制內(nèi)毒素可選用高毒力菌株增菌培養(yǎng)后刮下菌苔，然后按WestphaI熱酚法制備。也可用加熱殺死的高毒力陰性細(xì)菌苗懸液作粗制內(nèi)毒素。(3)靜脈注射內(nèi)毒素所致小鼠死多發(fā)生于24h內(nèi)，宜在24h內(nèi)記錄小鼠死亡時(shí)間。缺血性心臟病藥PPT82

(三)心源性休克模型1．原理用犬冠狀動(dòng)脈前降支分段結(jié)扎，結(jié)合冠狀插管阻流，使心肌缺血缺氧，心肌細(xì)胞受損，心肌收縮性能及心臟泵血功能明顯下降，全身血壓下降，使重要器官血液灌注不足而處于休克狀態(tài)。2．操作方法用犬以戊巴比妥鈉25mg／kg靜脈注射麻醉，分離股動(dòng)脈與股靜脈，靜脈插管連接二通，一側(cè)供輸液，一側(cè)供給藥。做氣管插管，接人工呼吸機(jī)。正中開胸，剪開心包，冠狀動(dòng)脈前降支末梢、根部下分別用小圓針穿入細(xì)絲線。股靜脈導(dǎo)管上連流量計(jì)探頭，將冠狀竇插管與導(dǎo)管另一端相連；從心耳剪—小口迅速插入冠狀竇插管，用粗線將心耳與插管扎上；從心底部沿房室溝將插管插入冠狀竇；輕輕扎住插管防止滑，保持回流導(dǎo)管暢通。頸外靜脈插入高敏感度壓力換能器達(dá)右心房測中心靜脈壓(CVP)，左股動(dòng)脈測平均動(dòng)脈壓。左頸總動(dòng)脈插入壓力換能導(dǎo)管直至左心室測左室壓峰值；同時(shí)測左室壓力變化速率正負(fù)最大值左室舒張末期壓(NEDP)。用體溫儀測下體溫。同時(shí)測心電圖(ECG)和心率(HR)和冠狀竇血流量(SCBF)，各項(xiàng)指標(biāo)均記錄于多道生理記錄儀。缺血性心臟病藥PPT823造模成功的指標(biāo)和藥物療效觀察待犬MAP穩(wěn)定在10kPa以上時(shí)，每隔5min順次結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支末梢、中部與根部，5-10min后阻斷冠狀竇血流。待MAP下降至9．3kPa或原血壓(10-13kPa)的70％以下者視為休克。從第一次結(jié)扎到MAP降至休克水平的平均時(shí)間為76．4min，休克動(dòng)物ECG均發(fā)生缺血性改變，MAP、LVSP均顯著下降，BT降低，CVP、LVEDP上升但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥效可根據(jù)紿藥后能否使休克動(dòng)物MAP增加，使LYEDP與冠狀血管阻力(CVR)和CVP下降，同時(shí)可用陽性藥多巴胺作對照。缺血性心臟病藥PPT82

4．注意點(diǎn)(1)麻醉不能過深，動(dòng)物MAP低于10kPa時(shí)棄去不用。(2)操作過程中盡量避免損傷血管，出血點(diǎn)應(yīng)結(jié)扎或燒灼止血。(3)冠狀插管不可插入太深，方向應(yīng)與心臟房室曲線吻合。(4)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈部位的次序不能錯(cuò)．先結(jié)扎根部易引起動(dòng)物死亡。(5)多巴胺(DOP)是公認(rèn)的治療心源性休克有效藥物之一，能明顯改善本休克模型心肌收縮性能與心肌供血，升高血壓等。缺血性心臟病藥PPT82(四)創(chuàng)傷性休克模型1．原理以—定重力自一定高度自由落下，造成股骨粉碎性骨折，用止血帶造成動(dòng)物體缺血再灌注損傷；反復(fù)錘擊動(dòng)物肌肉等均引起創(chuàng)傷性休克。2．操作方法取健康家兔，腹腔注入烏拉坦麻醉，頸總動(dòng)脈插管經(jīng)生理記錄儀監(jiān)測血壓，左股動(dòng)脈插管以備取血樣。創(chuàng)傷組以一定重力自一定高度自由落下，造成兔右側(cè)股骨中段粉碎性骨折；防治組創(chuàng)傷方法同上，創(chuàng)傷前l(fā)0min和創(chuàng)傷后即刻靜脈注入被試藥物；對照組插管手術(shù)同上，但不造成創(chuàng)傷。三組動(dòng)物血樣時(shí)間均相等。缺血性心臟病藥PPT82

3．造模成功的指標(biāo)和藥物療效觀察創(chuàng)傷組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后2h血壓降至6．82kPa，明顯低于防治組(11．76kPa)和對照組(13．5kPa)，，血漿乳酸脫氫酶和組織蛋白酶活性以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量均顯著高干防治組和對照組，同時(shí)心、肺、腎及胃黏膜等組織MDA含量和鈣含量較防治組和對照組明顯增高。創(chuàng)傷組動(dòng)物肺濕／干重量比明顯高于對照組，肺泡表面活性物質(zhì)顯著減少，創(chuàng)傷組動(dòng)物胃黏膜見點(diǎn)狀、條索狀和片狀缺損，并有血現(xiàn)象。4.注意點(diǎn)(1)每次造成創(chuàng)傷的物體重量、高度、創(chuàng)傷部位，嚴(yán)重程度要一致。(2)取樣時(shí)間要相等，測定各項(xiàng)指標(biāo)要精確。缺血性心臟病藥PPT82(五)腸系膜上動(dòng)脈夾閉性(sMAO)休克模型1原理休克的發(fā)生可能與腸道缺血再灌注時(shí)自由基及其他多種毒物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。自由基不僅導(dǎo)致腸組織的脂質(zhì)過氧化損傷，也可造成腸外生命器官如心、肺、肝等組織的脂質(zhì)過氧化損傷，自由基參與此休克時(shí)的細(xì)胞損傷過程。2．操作方法取純系大鼠，體重250g左右，用13．3％烏拉坦與l％氯醛糖混液06ml／100g(體重)腹腔注射麻醉，氣管插管，自主呼吸。左頸總動(dòng)脈插三通開關(guān)，按壓力換能器，連于二道生理記錄儀記錄血壓。右頸外靜脈插管供給藥用。腹部正中切于，生理鹽水紗布保護(hù)下分離出腸系膜上動(dòng)脈，以上創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉，關(guān)閉腹腔，動(dòng)物全身肝素化(80ul／100g(體重)]，關(guān)閉動(dòng)脈1h后松夾。給藥組可在松夾前20min右側(cè)頸外靜脈注入試驗(yàn)藥物。通過塑料三通左頸總動(dòng)脈取血，分別測定夾閉前、松夾后1h、2h三個(gè)時(shí)間的全血谷胱肽過氧化物酶活力。至松夾2h，取動(dòng)物心、肝、腎準(zhǔn)確稱量1g，測定GSH活力，按DTMB直接法測定。以Folim—酚試劑法作蛋白定量。對照組用等容量生理鹽水。其余條件均同給藥組。缺血性心臟病藥PPT823．造模成功的指標(biāo)和療效觀察造模成功的動(dòng)物在松夾即刻，松1h、2hMAP、脈壓均下降。全血及心、肝、腎組織活力降低。受試藥物應(yīng)能使MAP升高，全血及心、肝、腎組織GSH-Px活力明顯升高。4注意點(diǎn)①在分離大鼠腸系膜上動(dòng)脈時(shí)，盡量避免出血或過多牽拉。用無創(chuàng)傷動(dòng)脈夾閉要完全。②作勻漿前心、肝、腎組織盡量剪碎，勻漿時(shí)每次時(shí)間和頻率要保持一致。③必需注意各試劑的配制和保存方法，以免影響結(jié)果。④按酶學(xué)反應(yīng)的溫度、PH和時(shí)間進(jìn)行，同時(shí)須準(zhǔn)確計(jì)時(shí)和讀數(shù)。缺血性心臟病藥PPT82心律失常藥缺血性心臟病藥PPT82

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)心律失常是指心臟活動(dòng)節(jié)律不正常。正常情況下，心搏的激動(dòng)起源于竇房結(jié)，節(jié)律基本規(guī)則，頻率有—定范圍，沿竇房結(jié)——左右心房——心室的傳導(dǎo)途徑，以一定的速度傳播到左右心室。凡偏離這種正常心律的心臟搏動(dòng)都屬心律失常，它由心臟中節(jié)律性或激動(dòng)傳導(dǎo)障礙或二者同時(shí)失常引起。心律失常同時(shí)涉及心臟電活動(dòng)和機(jī)械性搏動(dòng)的節(jié)律，但雖明顯最精確地從心臟電活動(dòng)的改變中反映出來，因此心電圖是反映心律的最重要最直接的指標(biāo)。心臟的功能、血供、神經(jīng)調(diào)節(jié)等任—項(xiàng)異常均部分或完全引起心律失常，如各種器質(zhì)性心臟病、全身性疾病(感染、缺氧、中毒、電解質(zhì)紊亂、藥物作用)、某些系統(tǒng)疾病(甲亢、顱內(nèi)出血等)、麻醉、胸腔手術(shù)、自主神經(jīng)功能失調(diào)等。中醫(yī)學(xué)中類似心律失常癥狀的描述散見于心悸、怔忡、眩暈、昏厥等病癥中，病位以心為主，與肝、脾、腎、胃等關(guān)系密切，表現(xiàn)為虛(氣、血、臟腑)、實(shí)(瘀、滯、痰飲)兩類，虛多見于氣血不足，陰陽失調(diào)和血脈瘀阻等原因引起。缺血性心臟病藥PPT82心律失常的治療首先是確定病因，明確心律失常的發(fā)病因素及其相互關(guān)系，在治療病因的同時(shí)根據(jù)需要治療心律失?！，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)抗心律失常的藥物主要分為四類：鈉通道阻斷劑，它主要抑制內(nèi)向快速除極，鈉流動(dòng)，從而延長動(dòng)作電位上升速度，主要分為三個(gè)亞類：In除極作用中等，而復(fù)極延長，如奎尼丁、普魯卡因酰胺、雙異丙腎上腺素等；Ib兼有促進(jìn)K外流作用，除極作用弱，復(fù)極作用縮短(對P—R、QPS、QT無影響)，如利多卡因、美西律、妥卡尼、苯妥英鈉；lc除極作用強(qiáng)，復(fù)極作用甚小，如普羅帕酮、氟卡胺、Lorcninine等。Ⅱ類為腎上腺素能受體阻滯劑，如Nadolol、Pindolol、Sotolol、Timolol等。Ⅲ類為復(fù)極化抑制劑，如胺碘酮、Stolol等。Ⅳ類為鈣通道調(diào)節(jié)劑，阻斷鈣通道Ca內(nèi)流，使心肌細(xì)胞去極化減慢。中醫(yī)可用補(bǔ)益養(yǎng)血、滋陰和陽疏通血脈等方藥，防治“脈結(jié)代”，具抗心律失常的作用。受試中藥的其他相關(guān)藥效作用如補(bǔ)益、理氣等，可根據(jù)受試物的情況而增加。缺血性心臟病藥PPT82二、藥效學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(一)對心律失常模型的防治作用1．常用的動(dòng)物模型主要兩類模型。過速型心律失常模型。(1)電刺激心臟誘發(fā)心律失常：適度的電刺激接近自然異位沖動(dòng)，可誘發(fā)心律失常。(2)外科手術(shù)或機(jī)械損傷形成的心律失常：由傳導(dǎo)延緩和折返激動(dòng)以及舒張自動(dòng)除極和異常自律性所致。包括：①冠狀動(dòng)脈結(jié)扎形成缺血性心律失常；②冠狀兩期結(jié)扎形成心律失常。

缺血性心臟病藥PPT82(3)化學(xué)藥物誘發(fā)的心律失常：常用的有①腎上腺素誘發(fā)的心律失常。腎上腺素興奮受體，心臟自律性、傳導(dǎo)性、應(yīng)激性及心率提高，誘發(fā)室性心律失常，②氯仿誘發(fā)小鼠的心室纖顫?？赡芘c自主神經(jīng)及具遞質(zhì)釋放、或腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺索，以及對心臟的直接作用有關(guān)。③烏頭堿誘發(fā)的心律失常。能使鈣通道開放，促進(jìn)細(xì)胞去極化，加速起搏點(diǎn)的自柞性，形成多源性異位節(jié)律，縮短不應(yīng)期。④弧心苷誘發(fā)的心律失常。直接抑制Na—K-atp酶，使心肌細(xì)胞內(nèi)Na多K少，使心室自律性增高。⑤氯化鋇誘發(fā)的心律失常。增加蒲氏纖維Na內(nèi)流，提高舒張期去極化的頻串。⑥氯化鈣誘發(fā)的心律失常。鈣增加能降低蒲氏纖維的興奮性顯著增加普通心肌的去極化，導(dǎo)致局部傳導(dǎo)阻滯，并增加沖動(dòng)擴(kuò)散的不齊。⑦乙酰膽堿誘發(fā)的心律失常?？s短動(dòng)作電位及不應(yīng)期，使心肌不同部位興奮的擴(kuò)散不一致，導(dǎo)致折返形成。缺血性心臟病藥PPT82緩慢型心律失常模型(1)維拉帕米(異博定)誘發(fā)小鼠緩慢型心律失常：抑制心肌細(xì)胞內(nèi)Ca流，抑制房結(jié)和減慢房室傳導(dǎo)。(2)麻酐劑誘發(fā)的心動(dòng)過緩模型：尿酯能阻斷中樞神經(jīng)突觸傳遞，對心臟也有抑制作用，麻醉后出現(xiàn)一過性心率減慢，多在10min內(nèi)恢復(fù)正常。(3)煙堿誘發(fā)的心動(dòng)過緩模型：煙堿先興奮后抑制血管運(yùn)動(dòng)中樞、交感神經(jīng)節(jié)、腎上腺髓質(zhì)及頸動(dòng)脈化學(xué)感受，表現(xiàn)心率減慢、血壓下降、竇性停搏等。2．觀察指標(biāo)紀(jì)錄ECG，也可用心電示波器進(jìn)行監(jiān)測．觀察項(xiàng)目有①心律失常(室性早搏VP、室性心動(dòng)過速VT)出現(xiàn)的時(shí)間，心律失常程度，藥物作用的維持時(shí)間，恢復(fù)竇性心律動(dòng)物數(shù)／動(dòng)物總數(shù)。②房顫或室顫發(fā)生率和死亡率。③Ⅱ、Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯。缺血性心臟病藥PPT82

3．方法學(xué)評(píng)價(jià)(1)動(dòng)物：小動(dòng)物(大鼠、豚鼠、家兔、貓)的心室纖顫有自發(fā)恢復(fù)的可能，因?yàn)闆_動(dòng)在比較短的通路中，可能在仍處不應(yīng)期的區(qū)域內(nèi)消失，異常興奮波將不可能形成環(huán)形運(yùn)動(dòng)。豚鼠心臟地對心血管藥物的感受與人相似，兔耳靜注給藥方便，適宜在不麻酢條件實(shí)驗(yàn)，貓對作用于心臟的藥物感受性較好，體格健壯，適宜作開胸手術(shù)，固定電極等試驗(yàn)，大鼠易得．但對強(qiáng)心甘不敏感。大動(dòng)物(狗、猴、豬)心室纖顫很難自然恢復(fù)，研究病因狗最適宜，豬的冠狀血管系統(tǒng)與人相似，現(xiàn)在越來越多地采用小豬以冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的方法形成心律失常。(2)整體動(dòng)物形成的心律失常在麻醉或清醒狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)，不僅能觀察受試物的作用，后者還能觀察受試物的毒性。離體心臟標(biāo)本也可形成心律失常。缺血性心臟病藥PPT82(3)心律失常的恢復(fù)通常以恢復(fù)竇性心律，連續(xù)30min下再復(fù)發(fā)為恢復(fù)；心律失常持續(xù)時(shí)間以自心律失常一直到恢復(fù)竇性心律為止，減去中間間斷的恢復(fù)時(shí)間。(4)結(jié)扎冠脈、大鼠靜注烏頭堿形成的心律失常模型較穩(wěn)定和持久，可供實(shí)驗(yàn)治療，其他模型多用于預(yù)防給藥。(5)當(dāng)心律失常持續(xù)叫間較短，無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療時(shí)，采取先行給藥物，再造成心律失常，在同樣條件下，比較對照組與給藥組形成心律失常的時(shí)間、程度、持續(xù)時(shí)間或誘發(fā)心律失常所用化學(xué)物質(zhì)的劑量等，這可視為預(yù)防給藥的保護(hù)作用?？疾熘委熥饔每蛇x擇能維持心律失常較長叫間的動(dòng)物模型，心律失常發(fā)展的相對穩(wěn)定階段紿受試藥物，觀察指標(biāo)，判斷療效。缺血性心臟病藥PPT82

(二)其他試驗(yàn)1離體豚鼠右心室乳頭肌實(shí)驗(yàn)離體豚鼠右室乳頭肌標(biāo)本固定在改良臺(tái)氏液灌流槽中，給與基本節(jié)律電刺激，穩(wěn)定1-2h后，對竇房組織進(jìn)行微電極探查，找出竇房結(jié)搏起細(xì)胞，并使動(dòng)作電位穩(wěn)定，開始實(shí)驗(yàn)測定及記錄。實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)心肌細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)。基本節(jié)律刺激的參數(shù)為波寬1ms，頻率1Hz，強(qiáng)度為閾強(qiáng)度的2倍，對同一細(xì)胞分別紀(jì)錄和測試給藥前、后和沖洗的動(dòng)作電位變化ERP的變化，將細(xì)胞分組給予奎尼丁50ug和待測藥物。2離體家兔竇房結(jié)起搏細(xì)胞動(dòng)作電位將制好的家免竇房結(jié)標(biāo)本固定在充以95％O2+5％CO2的R-L液灌流槽中．穩(wěn)定1-2h，對竇房結(jié)進(jìn)行微電極探查，找出竇房結(jié)起搏細(xì)胞，并使動(dòng)作電位穩(wěn)定，然后分別紀(jì)錄細(xì)胞在給與待測藥物前、后和洗后的動(dòng)作電位變化，比較：MPR、APD、SRVP4、SEF和APA。缺血性心臟病藥PPT82(三)陽性對照藥與已知公認(rèn)臨床療效較好的類似藥進(jìn)行對照，最好選用作用類別相似的中藥成藥，也可酌情用療效明確的西藥及新藥。受試藥給藥方法中至少有一種與臨床相同。如果受試藥為中藥提純物，水溶的可用靜注或具他注射方法，如系中藥粗制劑，一定要灌胃或注入十二指腸內(nèi)，口服或灌胃通常在形成心律失常前1h或更長時(shí)間給藥，腹腔注射或十二指腸注入應(yīng)在10～15min前，皮下、肌內(nèi)注射通常在2