淋巴細胞的分離與培養(yǎng)楊星1淋巴細胞的分離

人淋巴細胞的方便來源是外周血，分離的原則是收率較高、純度較好、失活較低。根據(jù)不同試驗有相對純度，無論采用哪種方法，應盡最大可能保持細胞應有活性。分離的技術(shù)可由細胞的物理性狀和表面標志設(shè)計，根據(jù)不同實驗目的可采用密度梯度離心法、吸附分離法和其它特殊分離法。2外周血紅細胞粒細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

1.092密度分類（PBMC）3密度梯度離心法原理：外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。4（一）Ficoll分層液法

Ficoll為合成性蔗糖聚合物的商品名，無毒，但高濃度溶液往往不等滲，且粘性高，易使細胞聚集。組成：2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液+1份泛影葡胺生理鹽水Ficoll分層液法主要用于分離外周血中的單個核細胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。分離人外周淋巴細胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳。別名：淋巴細胞分離液5實驗方法1.采血，稀釋（外周血：稀釋液=1：2）2.在離心管中加入Ficoll，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血（Ficoll：稀釋血=1：2）63.20℃，1500r/min，離心30min

1500rpm,20℃

,30minPBMC紅細胞、粒細胞稀釋的血漿、血小板FicollFicoll74.沿管壁周緣輕輕吸取PBMC層移入另一試管中。5.加足量稀釋液充分洗滌，1800r/min離心10min，棄上清。6.重復洗滌一次，1400r/min離心10min，棄上清。7.適量的培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)。分離單個核細胞純度為95%。淋巴細胞約占90%～95%。8（二）Percoll分層液法1、一種連續(xù)密度梯度離心分離法。2、主要成分：硅膠顆粒，其大小不一，經(jīng)高速離心后形成連續(xù)密度梯度。

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PBMC懸液主要含淋巴細胞，但一般還混雜有數(shù)量不等的單核細胞及少量粒細胞、紅細胞和血小板。那么怎樣獲得高純度的淋巴細胞及其亞群呢？10淋巴細胞及其亞群的分離(一)紅細胞的去除一般采用無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。(二)血小板的去除將PBMC懸液通過離心洗滌2～3次，?？扇コ齈BMC中絕大部分混雜的血小板。在某些疾病狀態(tài)下，若外周血中血小板數(shù)量異常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度離心法去除PBMC中混雜的血小板。11(三)單核細胞和粒細胞的去除1．粘附去除法

原理：單核細胞和粒細胞在37℃和Ca離子存在條件下能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠。采集的非粘附細胞即為淋巴細胞。優(yōu)點：簡便易行，對細胞損傷極少。缺點：B細胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細胞丟失。該法去除單核細胞后，大約95%的單個核細胞為淋巴細胞，活性大于95%。122．羰基鐵粉吞噬法

原理：單核細胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細胞密度增大。方法一：經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心后，則單核細胞沉積于管底而被去除。方法二：用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中即含較純的淋巴細胞。133．苯丙氨酸甲酯去除法

?原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有親溶酶體性質(zhì)，能滲入細胞溶酶體內(nèi)被水解為游離氨基酸，導致溶酶體內(nèi)因滲透壓改變而破裂，釋放出的酶類物質(zhì)可引起細胞溶解。?用該法可溶解含溶酶體的細胞，如單核細胞、粒細胞和成纖維母細胞等，B細胞和大多數(shù)T細胞因缺乏溶酶體酶，因而不受影響。?該法去除單核細胞后，約99%的單個核細胞為淋巴細胞，活性大于95%。14（四）、淋巴細胞亞群的分離原理：根據(jù)相應細胞的特性和不同的標志加以選擇性純化。常用方法：（1）E花環(huán)分離法（2）尼龍纖維分離法（3）流式細胞術(shù)（4）磁珠分離術(shù)（5）親和板結(jié)合分離法15(1)E花環(huán)分離法原理：人類T細胞表面上有能與綿羊紅細胞相結(jié)合的受體（E受體，CD2）,能與經(jīng)溴化二氨基異硫基異硫脲氰化物（AET）處理的綿羊紅細胞結(jié)合，形成穩(wěn)定的、細胞體積和比重較大的E花環(huán)。方法：淋巴細胞+SRBC懸液→加入分層液→T細胞形成E花環(huán)而沉于管底→懸液中為B細胞。16E花環(huán)1718（2）尼龍纖維分離法

原理：B細胞在37℃時易粘附于尼龍棉（聚酰胺）纖維上，而T細胞不具此能力。方法：淋巴細胞→通過聚酰胺纖維管→洗脫下來的是T細胞。19（3）流式細胞術(shù)又叫熒光激活細胞分離儀(nuorescenceactivatedcellsorter,FACS)法

原理：

細胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細胞排成單行，逐個流經(jīng)檢測區(qū)進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴(4000個/s)，每小滴內(nèi)最多含一個細胞，細胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細胞的類型。

20激發(fā)系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)熒光激活細胞分離儀分離法

檢測與訊號處理系統(tǒng)細胞流動系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)21流式細胞分析儀22（4）磁珠分離術(shù)

磁珠分離術(shù)是將磁性材料顆粒表面進行外理，微球的核心為小金屬顆粒，核心處包裹高分子材料（聚苯乙烯），可結(jié)合不同的生物大分子物質(zhì)（抗原、抗體、核酸等），若微球表面包被有免疫物質(zhì)則稱為免疫磁珠，其兼有免疫配基的性質(zhì)和磁響應性質(zhì)，即在磁場中顯示磁性，移出磁場時磁性消除。

目前商品出售的磁珠有直徑為1～5um等不同的規(guī)格，表面活性基團有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羥基（－OH）等。

包被的免疫物質(zhì)有：一抗、二抗等。23方法：

將包被有關(guān)抗體的磁珠與待分離細胞充分作用，這樣借助于抗體磁珠，將與相應的細胞結(jié)合成：細胞－抗體－磁珠復合物，該細胞在磁場中運動與其他細胞產(chǎn)生明顯差別。

如采用層析的方法，將層析柱放于強磁場中，與磁珠結(jié)合的細胞運動將受限，而未與磁珠結(jié)合的細胞將先被洗脫下出來。

再將該柱移出磁場，與磁珠結(jié)合的細胞也將被洗脫下來，達到分離目的。24單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球Biomag抗CD3磁球磁球結(jié)合T細胞加入B和T細胞中負向選擇正向選擇磁架進行分離直接法對細胞進行分類間接法對T細胞進行分離25免疫磁珠法細胞分選過程26免疫磁珠細胞分選裝置27（5）親和板結(jié)合分離法原理：各種淋巴細胞亞群具有不同的抗性。①分離CD4+或CD8+細胞，可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。②分離B細胞用抗Ig抗體。③分離有C3受體的細胞用活化的C3包被。28將相應抗體結(jié)合于塑料平板上抗原陽性的細胞與相應抗體結(jié)合29淋巴細胞的保存和活力測定1、分離細胞的保存（1）短期保存用含有10～20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640培養(yǎng)液可保存數(shù)周。30（2）長期保存及復蘇保存：在保護劑二甲基亞砜中于液氮（-196℃)中保存。其過程是：先對需凍存的細胞作活細胞計數(shù)，低速離心后，取沉積細胞用含有10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當濃度的細胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，立即放入降溫過渡站(-80℃)中，繼而進行降溫(-196℃)冷凍。復蘇：將其從液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后加入10倍的培養(yǎng)液混勻，低速離心，洗去保護劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計數(shù)并檢查細胞活力。312、細胞活力的檢測

常用方法是臺盼藍染色法。這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞而使細胞著色（藍色）。32淋巴細胞的培養(yǎng)正常情況下，人外周血中是沒有分裂相細胞的，只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。外周血淋巴細胞一般情況下處于增殖期中的G1期，未經(jīng)培養(yǎng)的外周血中很難找到正在分裂的淋巴細胞。植物血細胞凝集素(PHA)是人類淋巴細胞有絲分裂的刺激劑，在PHA作用下，能使處于G1期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，進而進行有絲分裂。利用PHA這一特性，淋巴細胞經(jīng)過含有PHA培養(yǎng)液培養(yǎng)，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細胞群體，加之，淋巴細胞遍及全身，并在所有器官組織中不斷循環(huán)，能反映個體整體水平情況而不象體細胞那樣具有局限性。33培養(yǎng)條件1、無污染環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件，也是實驗成功與否的先決條件。收獲細胞前的所有步驟都要保持高度的無菌，嚴防細菌和病毒的污染。當細胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內(nèi)相比細胞丟失了對生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導致細胞死亡。342、恒定的溫度維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36．5±0．5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。如果溫度高于37℃，細胞的生長速度減慢；如果溫度高于40℃，細胞受損，超過43℃，則導致細胞死亡。培養(yǎng)箱的溫度應嚴格控制在37±0.5℃，為了能精確有效的控溫，在普通的隔水式恒溫培養(yǎng)箱上可加裝一個電子控溫儀。若溫度過高或過低，則會延緩分裂周期，造成收獲時細胞分裂相減少。353、氣體環(huán)境氣體是人體細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有02和C02。C02既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞生長繁殖所需成分，他在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值。大多數(shù)細胞的適宜pH為7.2～7.4，培養(yǎng)基的pH值也應調(diào)整到7.2～7.4之間，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。偏酸時細胞發(fā)育不良，偏堿時細胞會出現(xiàn)輕度固縮。細胞培養(yǎng)液pI-I的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO，的方法，因為NaHCO3，可供C02，但C02易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)。364、培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)基、培養(yǎng)用無機鹽、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴細胞分離液、植物凝集素(PHA)和白細胞介素等。植物凝集素(PHA)是體外淋巴細胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，只有在PHA的作用下才能進入有絲分裂，因此要考慮它的質(zhì)量和嘗試，質(zhì)量有問題藥效會降低，濃度過高可能會導致紅細胞凝集，都會造成實驗效果差。37操作步驟1、洗滌將收集到的淋巴細胞集中于離心管中用培養(yǎng)液洗滌兩次，分別以2500和2000rpm離心各10min，棄上清，之后進行接種。2、細胞接種細胞接種通常是在無菌室超凈工作臺內(nèi)的酒精燈火焰區(qū)進行。接種時無菌操作是否規(guī)范，直接影響到細胞培養(yǎng)的成敗。如接種時如不慎將手接觸到培養(yǎng)瓶的瓶塞，或接觸了注射器的針頭，可能會造成細菌中霉菌的污染。接種操作是在酒精燈附近進行，接種時還應注意避免高溫破壞。操作時手與酒精燈的距離以火焰不燙手為宜，離火焰太近，細胞可能被破壞，甚至被燒焦成塊，肉眼可見呈團塊；同時也會造成針頭堵塞。出現(xiàn)這種情況，應及時更換針頭。如已接種，應更換一瓶培養(yǎng)液。383、搖床培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)瓶放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。從72h開始每48h添加等體積的新鮮培養(yǎng)液。39注意事項一、嚴格無菌操作對實驗室以及培養(yǎng)過程中所接觸的試劑、液體、器皿、儀器的消毒,均應嚴格按照有關(guān)細胞培養(yǎng)的參考書的要求進行操作。無菌觀念要貫穿整個實驗的始終,不可松懈。二、血清的選擇淋巴細胞對血清的要求較高,所以選用血清時要注意生產(chǎn)廠家。但胎牛血清價格昂貴,新生小牛血清或小牛血清也價格不菲,而使用自身血清不僅細胞長得好,而且更接近體內(nèi)環(huán)境,避免了外來因素的干擾,使實驗設(shè)計更嚴密。血清濃度在5%～20%時細胞生長比較好,當超過30%時反而不利于細胞生長。40三、pH值細胞生長的最適pH為7.0～7.2,可忍耐的pH范圍為6.6～7.8,當pH低于6.8或大于7.6時,都會抑制細胞生長。RPMI1640培養(yǎng)基加入血清后pH值一般升高0.2～0.4,故配1640培養(yǎng)液及其他用液時使pH值達到7.2比較合適,并且需經(jīng)常檢測pH值。四、培養(yǎng)空間培養(yǎng)液與液面上的空間二者的體積比例一般以1∶10為宜,培養(yǎng)液液面高度最好維持在2～5mm的范圍,以便于氣體交換。五、恒溫培養(yǎng)箱溫度應維持在37℃,CO2濃度為5%,O2為95%,100%的飽和濕度。41常見失敗原因

1.污染污染仍是細胞培養(yǎng)失敗的主要原因,包括細菌和真菌,中藥制劑尤易出