質(zhì)粒DNA的提取、擴增和鑒定實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)質(zhì)粒的相關(guān)基本知識；掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理和方法。質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。常見的天然質(zhì)粒有F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:

緊密控制型(Stringentcontrol)

松馳控制型(Relaxedcontrol)

前者只在細(xì)胞周期的一定階段進行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時，它也不能復(fù)制，通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒,如F因子。后者的質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制，在每個細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20個以上，如Col質(zhì)粒。一個理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有的特性:（1）分子量小；（2）多拷貝、松馳控制型；（3）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點,即多克隆位點(MCS,multiplecloningsites)；（4）能插入較大的外源DNA片段；（5）具有容易操作的檢測表型。如抗生素抗性、a-互補顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，克隆載體如:pGEM-T、pUCm-T和pBluescript（簡稱pBS）等，表達載體如:p1300質(zhì)粒等質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實驗室操作而進行人工構(gòu)建的。常用的質(zhì)粒載體可以分為克隆載體和表達載體pBluescriptII儀器、試劑和材料

1、設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺式離心機、超凈工作臺、PCR儀、高壓滅菌鍋、瓊脂糖凝膠電泳及分析系統(tǒng)等。2、試劑：Tris、EDTA、SDS、含質(zhì)粒大腸桿菌、瓊脂糖、溴化乙錠、DNAmarker等。超凈工作臺制冰機高速冷凍離心機水平電泳裝置

利用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測質(zhì)粒DNA提取的實驗原理利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離的目的。在堿變性條件下，細(xì)菌在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生變性，但是染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔?，雙螺旋也有部分解開，但共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補鏈不會完全分離。實驗原理當(dāng)pH=4.8的乙酸鉀將其pH調(diào)到中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。同時，在反應(yīng)體系中變性的蛋白質(zhì)會形成大量沉淀以及十二烷基磺酸鉀沉淀，染色體DNA會進一步纏繞在這些沉淀上。離心后，染色體DNA與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，質(zhì)粒DNA留在上清里。（1）取液體培養(yǎng)菌液10mL置離心管中，10000r/min離心10min去掉上清液。加入150μL的GET緩沖液，充分混勻，在室溫下放置10min。

（2）加入200μL新配置的0.2mol/LNaOH，1%SDS。加蓋，顛倒2~3次使之混勻。冰上放置5min。SDS能使細(xì)胞膜裂解，并使蛋白質(zhì)變性。質(zhì)粒DNA的提取步驟（3）加150μL冷卻的乙酸鉀溶液，加蓋后顛倒數(shù)次混勻，冰上放置15min。10000r/min離心5min，上清液倒入另一離心管中。乙酸鉀能沉淀SDS和SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物。在冰上放置15min是為了使沉淀完全。（4）向上清液中加入等體積酚/氯仿，震蕩混勻，10000r/min離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

（5）向上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置2min。離心5min，倒去上清乙醇溶液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體，然后加入50μL的TE緩沖液保存。PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextensionPCR

productPCR反應(yīng)曲線標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ulPCR反應(yīng)五要素引物（primer）

酶（TaqDNApolymerase）

dNTP

（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增引物設(shè)計的原則（一）①引物長度：

15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴增長至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列引物設(shè)計的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對

特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處引物設(shè)計的原則（三）⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少dNTP

的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP

能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低模板（靶基因，targetgene）模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸模板（靶基因，targetgene）提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNAMg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的

PCR反應(yīng)中，各種NTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時間循環(huán)次數(shù)溫度與時間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗

②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時間：根據(jù)待擴增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10Kb需延伸至15min延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多PCR反應(yīng)特點特異性強靈敏度高簡便、快速對標(biāo)本的純度要求低1.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL

質(zhì)粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)

水補充至25.0μL操作步驟PCR技術(shù)的基本過程模板DNAdNTP

引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP

引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’

基本過程PCR技術(shù)的基本過程Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer72℃7min循環(huán)25次反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液與凝膠電泳緩沖液按比例混勻,上樣電泳。操作步驟瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳法凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)制備凝膠的材料:

瓊脂糖電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺電泳一、實驗?zāi)康?/p>

掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。二、實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。

注意事項：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。實驗過程中操作要保持安靜、鎮(zhèn)定，注意樣品不能混樣，實驗材料、器具及藥品

實驗中提取的質(zhì)粒樣品。

電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。

瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），10X載樣緩沖液

實驗步驟

⑴0.5g

瓊脂糖加入50ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖中加入0.5mlEB（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取4μl

樣品溶解液，混勻后，小心加入點樣孔。

⑸打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約40min-60min。（6）將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。質(zhì)粒DNA應(yīng)呈現(xiàn)二或三條不同構(gòu)型的條帶，這時表明所提樣品較純。溴酚藍(lán)前的熒光區(qū)是樣品中存有的RNA雜質(zhì)。若質(zhì)粒DNA樣品在遷移率小的地方還有熒光條帶，表明質(zhì)粒DNA樣品中有細(xì)菌的染色體DNA污染。（1）瓊脂糖含液體量大，可達98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小。（2）電泳速度快。（3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。（4）樣品易回收，常用于制備。瓊脂糖電泳的優(yōu)點配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來確定。

瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

開環(huán)(部分解鏈)閉環(huán)(螺旋)閉環(huán)(超螺旋)質(zhì)粒DNA1、學(xué)習(xí)酶的純化方法，酶蛋白分離提純的原理。2、學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破壁、有機溶劑分級和離子交換柱層析技術(shù)。本實驗可以為大家提供一個較全面的實踐機會，學(xué)習(xí)如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對這種酶的性質(zhì)，尤其是動力學(xué)性質(zhì)作初步的研究。酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究

實驗原理酶是生物體內(nèi)具有催化功能的蛋白質(zhì)，可據(jù)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇分離提純條件和含量測定方法。酶分離提純的總目標(biāo)是提高純度（或比活力）及收率；依據(jù)在溶液中的性質(zhì)（分子大小、溶解度、電荷、吸附等）進行分離;胞內(nèi)酶的分離提純步驟：選材、破壁、提取、分離、純化、測活、保存；用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度和得率。酶促反應(yīng)的動力學(xué)（反應(yīng)速度及影響因素）:1）底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響2）酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響3）pH值對酶促反應(yīng)速度的影響4）溫度對酶促反應(yīng)速度的影響5）激活劑、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響.自1860年Bertholet從啤酒酵母（Sacchacomyces

Cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來，它已被廣泛地進行了研究。蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的β-呋喃果糖糖苷鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。

實驗原理

本實驗提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶，含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個亞基比內(nèi)酶多兩個氨基酸，Ser和Met，它們的分子量也不同，外酶約為27萬(或22萬，與酵母的來源有關(guān))，內(nèi)酶約為13.5萬。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，因此，本實驗未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實驗提取純化的主要是外酶。名稱MW糖含量亞基為蔗糖的Km為棉子糖的KmpI

最適pH穩(wěn)定pH最適溫度外酶27萬50%雙26mM150mM5.04.93.0-7.560℃內(nèi)酶13.5萬＜3%雙25mM150mM5.04.56.0-9.060℃實驗中，用測定生成還原糖（葡萄糖和果糖）的量來測定蔗糖水解的速度，在給定的實驗條件下，每分鐘水解底物的量定為蔗糖酶的活力單位。比活力為每毫克蛋白質(zhì)的活力單位數(shù)。兩種酶的性質(zhì)對照表如下：一、蔗糖酶的提取與部分純化二、離子交換柱層析純化蔗糖酶三、蔗糖酶各級分活性及蛋白質(zhì)含量的測定本實驗分三個方面實驗：細(xì)胞破壁的幾種方法1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。4、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。5、化學(xué)處理法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。6、有機溶劑沉淀法：即向水溶液中加入一定量的親水性的有機溶劑可降低溶質(zhì)的溶解度使其沉淀被析出。（一）蔗糖酶的提取與部分純化（1）準(zhǔn)備一個冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。（2）稱取3g干啤酒酵母，稱20mg蝸牛酶及適量（約3g）二氧化硅，放入研缽中。二氧化硅要預(yù)先研細(xì)。（3）量取預(yù)冷的甲苯6ml+6ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需40分鐘。研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細(xì)胞大部分研碎。（4）緩慢加入預(yù)冷的20ml去離子水，每次加2ml左右，邊加邊研磨，至少用20分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。（5）將混合物轉(zhuǎn)入兩個離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機離心，4℃，5000rpm，15min。如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機相。

（6）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個清潔的離心管中。操作步驟4℃，5000rpm，離心15min。（7）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。（8）用廣泛pH試紙檢查清液pH，用1M乙酸將pH調(diào)至5.0，稱為“粗級分I”。2.熱處理

（1）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到50℃，將盛有粗級分I的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，50℃下保溫30分鐘，在保溫過程中不斷輕搖離心管。（2）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，用4℃，5000rpm，離心15min。（3）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出1.5ml測定酶活力及蛋白質(zhì)含量（稱為“熱級分II”）。3.乙醇沉淀

將熱級分II轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰鹽?。]有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預(yù)冷至-20℃的95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30分鐘，再在冰鹽浴中放置10分鐘，以沉淀完全。于4℃，5000rpm，離心15min，傾去上清，并風(fēng)干，沉淀保存于離心管中，蓋上蓋子，然后將其放入冰箱中冷凍保存（稱為“醇級分Ⅲ”）。離子交換層析

離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項技術(shù)。

在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團，當(dāng)結(jié)合陽離子基團時，可換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素。在纖維素上結(jié)合了DEAE，含有帶正電荷的陽離子纖維素—O—C6H14NH+，它的反離子為陰離子（如Cl-等），可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)陰離子進行交換。當(dāng)結(jié)合陰離子基團時，可置換陽離子，稱為陽離子交換劑，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纖維素。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離子（纖維素－O－CH2－COO-），其反離子為陽離子（如Na+等）,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽離子進行交換。溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點相同時，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點時，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點時，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質(zhì)等電點越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。

在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，溶液的pH值高于等電點時，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當(dāng)溶液的pH值低于等電點時，蛋白質(zhì)被陽離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液pH值發(fā)生改變，就會直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個分離開來。交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機鹽離子（如NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)兩者同時存在于一個層析過程中，則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。當(dāng)Cl-的濃度大時，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng)Cl-濃度小時，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強度，一種是改變洗脫液的pH值。pH值增高時，抑制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對陰離子交換劑的吸附。當(dāng)使用陰離子交換劑時，增加鹽離子，則降低pH值。當(dāng)使用陽離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為Na型（即平衡離子是Na離子），陰離子交換劑為Cl型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH或再加一定的NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為Na型，陰離子交換劑為Cl型。使用的酸堿濃度一般小于0.5mol/L，浸泡時間一般30min。處理時應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。柱上操作⑴交換劑裝柱最簡單的交換層析柱可用堿式滴定管代替。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。

⑵上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液⑶洗脫與收集

不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著的物質(zhì)往往不是我們所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質(zhì)。離子交換柱層析純化蔗糖酶操作步驟1.離子交換劑的處理：稱取1.5克DEAE纖維素（DE-23）干粉，加入0.5MNaOH溶液（約50ml），輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時（不超過1小時），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50ml0.5MHCl,攪勻，浸泡0.5小時，同上，用去離子水洗至近中性，再用0.5MNaOH重復(fù)處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。（因DEAE纖維素昂貴，用后務(wù)必回收）。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過回收的，按“堿→鹽”的順序洗即可（0.5MNaOH,1MNaCl溶液處理），然后水洗至中性。最后保存在20%的酒精溶液中。2.裝柱與平衡：

先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用0.02mol/LpH7.3Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導(dǎo)率與緩沖液相同或接近時即可上樣。（一般洗2-3個柱體積）3.上樣與洗脫：上樣前先準(zhǔn)備好梯度洗脫液，本實驗采用30ml0.02MpH7.3的Tris-HCl緩沖液和30ml含0.2MNaCl的0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl緩沖液，進行線性梯度洗脫。取兩個相同直徑的50ml量杯，一個裝30ml含NaCl的高離子強度溶液，另一個裝入30ml低離子強度溶液，放在磁力攪拌器上，在低離子強度溶液的量杯內(nèi)放入一個小攪拌子，使兩杯溶液形成連通，注意兩個杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。

用5ml0.02MpH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分Ⅲ，若溶液混濁，則用小試管，4000rpm離心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇級分Ⅲ樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量），將剩余的3.5ml清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管3.0ml/10min。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約20ml緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì)，至A280降到0.1以下，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細(xì)塑料導(dǎo)管放入不含NaCl的低離子強度溶液的小燒杯中，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余30ml高離子強度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速3.0ml/10min。

測定每管洗脫液的A280光吸收值，合并活性最高的2-3管，量出總體積，此即“柱級分IV”。注意：從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始后洗下來的活性峰。各級分蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮蘭染料法（Bradford法）的微量法測定蛋白質(zhì)含量，參見實驗－“蛋白質(zhì)含量的測定法”。各級分先要仔細(xì)尋找和試測出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細(xì)記錄稀釋倍數(shù)的計算（使用移液管和量筒稀釋）。下列稀釋倍數(shù)僅供參考：粗級分I：10～50倍熱級分II：10～50倍醇級分III：10～50倍柱級分IV：不稀釋12345待測樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)00.020.040.060.080.1雙蒸水ml0.10.080.060.040.020考馬斯亮藍(lán)ml555555A595蛋白質(zhì)含量的測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度：1mg/ml蔗糖酶各級分活性的測定

測定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費林試劑法、Nelson’s試劑法、水楊酸試劑法等，本實驗先使用費林試劑法，以后測米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax時再用Nelson’s試劑法。費林試劑法靈敏度較高，但數(shù)據(jù)波動較大，因為反應(yīng)后溶液的顏色隨時間會有變化，因此加樣和測定光吸收值時最好能計時。其原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于650nm測定光吸收值。級分I、II、III蔗糖酶活性測定用去離子水代替稀釋各級分酶液，試測出測酶活合適的稀釋倍數(shù)：I：1000～10000倍

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