細胞培養(yǎng)基本知識一．細胞（組織）培養(yǎng)的概念及意義

（一）細胞的基本知識

1．細胞及細胞學(xué)說的提出：1665年英國學(xué)者RobertHooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）這個詞稱呼他們看到的類似于蜂巢的極小的封閉小室。

德國植物學(xué)家施萊登（１８３８.Ｍ.ＪＳchleiden），動物學(xué)家施旺（１８３９，T.schwann）提出動植物都是細胞的集合物。使細胞及其功能有了一個較為明確的定義，確立了“細胞學(xué)說”的基本原則。這時"細胞學(xué)說"主要內(nèi)容是：（１）細胞是有機體，動植物都是由細胞發(fā)育來的；（２）每個細胞都作為一個相對的獨立單位，有自己的"生命"。（３）新的細胞可以通過老的細胞繁殖產(chǎn)生。

１８５８年德國醫(yī)生病理學(xué)家微耳赫（Virchow）指出細胞只能來自細胞，正如動物只能來自動物，植物只能來自植物一樣。他還指出機體的一切病理表現(xiàn)都是基于細胞的損傷。施旺、施萊登的細胞學(xué)說，1859年達爾文(Darwin)的進化論，1866年孟德爾（Mendel）的遺傳學(xué)定為現(xiàn)代生物學(xué)的三大基石，而細胞學(xué)說又是后二者的"基石"。2．細胞的基本概念

（1）細胞是生命活動的基本單位：細胞是生命活動的基本單位，一切機體均由細胞構(gòu)成（病毒是非細胞形態(tài)的生命體）。細胞不僅是機體的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)單位，也是機體的基本功能單位，機體的生長、發(fā)育、繁殖和進化都是以細胞為基礎(chǔ)。細胞同時也是機體發(fā)生退行性變與發(fā)生疾病的基礎(chǔ)。（2）細胞的基本共性：構(gòu)成細胞的基本化學(xué)因素只有O、C、H、N、P、S、Ca、K、Fe、Na、Cl、Mg等，它們構(gòu)成細胞功能與結(jié)構(gòu)所需的許多無機化合物和各種生物分子。構(gòu)成細胞結(jié)構(gòu)的基本生物大分子是：核酸、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類。這些大分子一般以復(fù)合分子形成如核蛋白、脂蛋白、糖蛋白或糖脂等組成細胞的重要結(jié)構(gòu)。

在亞顯微結(jié)構(gòu)水平上，細胞基本結(jié)構(gòu)大體可以分成三種體系：主要由脂蛋白構(gòu)成的生物膜系統(tǒng)，如細胞膜、核膜及一系列重要細胞器如：線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和液泡等的封閉膜；第二類主要由核酸蛋白成分構(gòu)成的顆粒與顯微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，如染色質(zhì)與核仁基質(zhì)，核蛋白體等；第三類由蛋白質(zhì)構(gòu)成的細胞骨架（主要是微絲與微管），中心體、紡錘體、纖毛、鞭毛等專門結(jié)構(gòu)。（3）細胞作為生命活動的基本單位的共同特點：首先所有細胞表面均有一層脂蛋白成分的生物膜，即細胞膜，使細胞能與周圍環(huán)境保持相對獨立性；

其次，所有細胞都有兩種核酸，即DNA和RNA作為遺傳信息的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)基礎(chǔ)；

第三作為蛋白質(zhì)合成的“機器”-核蛋白，是一切細胞不可缺少的基本結(jié)構(gòu)；

第四所有細胞都是以一分為二的分裂方式增殖。第五，細胞具有多樣性，形狀、大小懸殊很大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度也很不一樣。（4）原核細胞與真核細胞：這兩種細胞是根據(jù)進化程度與結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度來劃分的。原核細胞（Procaryticcell）它沒有典型的核結(jié)構(gòu)，沒有核膜，只有一個比較集中的核區(qū)，其中分布著環(huán)狀DNA絲，細胞內(nèi)缺少重要細胞器，但有時有核蛋白體及游離的質(zhì)粒（Plasmid），原核細胞的繁殖以直接分裂（無絲分裂）為主，DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成同時連續(xù)進行。從進化角度真核細胞與原核細胞有兩點區(qū)別，第一細胞膜系統(tǒng)的分化與演變不同。真核細胞以膜系統(tǒng)的分化為基礎(chǔ)，分化成各種重要的細胞器；第二遺傳信息與遺傳裝置的擴增與復(fù)雜化程度不一。真核細胞（Eucaryoticcell）進化程度高，結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜。（二）組織（細胞）培養(yǎng)

1．組織（細胞）培養(yǎng)的概念和進展：

組織（細胞）培養(yǎng)是指從生物體內(nèi)取出細胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。

本世紀初（1907年）美國科學(xué)家Harrison和carrel創(chuàng)建的，以淋巴液為培養(yǎng)基在試管內(nèi)成功的培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織。50年代人們在培養(yǎng)容器、培養(yǎng)液及技術(shù)操作上都進行了大的改進，使細胞培養(yǎng)進入一個突飛猛進的發(fā)展階段。70-80年代，隨著遺傳缺陷細胞株的培育，雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，癌基因轉(zhuǎn)染及基因工程出現(xiàn)，使細胞培養(yǎng)技術(shù)不僅用于研究生命科學(xué)，也成為生物工程和基因工程的生產(chǎn)手段。2．組織（細胞）培養(yǎng)選材：根據(jù)實驗?zāi)康?，觀察指標決定組織（器官）或是單個細胞。細胞培養(yǎng)是用剪碎的小組織塊或分離的單個細胞進行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)將會失去原有組織類型及某些生化特性，但它們可以增殖，可以特性化，可以獲得遺傳背景相同的群體，可以保存。培養(yǎng)選材一般來自胚胎組織的培養(yǎng)物比成體組織更易生存、生長，這主要是因為胚胎組織有更多的胚胎干細胞（ESC）它們具有更高的自我更新和多能分化的能力。3．原代與傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)一般指細胞從組織中分離在體外生長至傳代之前的細胞培養(yǎng)。這種培養(yǎng)通常是異質(zhì)地，生長緩慢，比較能代表原組織的細胞類型，表達原組織特性，但在培養(yǎng)過程中會失去許多原組織的細胞。原代細胞生長物或細胞系生長到一定階段，分散成單個細胞，按一定比例接種于新的培養(yǎng)容器內(nèi)稱之傳代。傳代細胞稱之細胞系可分為兩類：有限細胞系，連續(xù)細胞系。傳代形成的具有各自生物特性或標志的細胞系稱之為細胞株（Cellstrain)4.組織（細胞）培養(yǎng)的醫(yī)學(xué)生物學(xué)意義

（1）培養(yǎng)的組織器官或細胞，能在一定范圍和程度上反映生命活動規(guī)律和機體功能特點。培養(yǎng)的細胞為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)各種研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)（2）細胞培養(yǎng)與生物工程：細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為商品化生物技術(shù)的核心。如目前可提供的產(chǎn)品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗、乙肝疫苗；非抗體型免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白介素、集落刺激因子；多肽生長因子：表皮生長因子、神經(jīng)生長因子；酶類：組織型纖溶酶原激活劑；激素：EPO、促黃體生成素；殺蟲劑：桿狀病毒；腫瘤特異抗原：癌胚抗原；通過雜交瘤生產(chǎn)的各種單克隆抗體；細胞本身；皮膚重植等。（3）細胞培養(yǎng)技術(shù)的商業(yè)化：對于生物技術(shù)所使用的各種細胞株的價值，很難作出評價。1998年，美國市場就達3.5-4億美元，而且還以6-8%的速度在增長。下邊介紹幾家美國細胞株供應(yīng)公司和機構(gòu)。名稱網(wǎng)址

Invitrogan

www.Invitrogen.com

有關(guān)不同細胞株的用戶論壇

ATCCwww.atcc.org

各種細胞株的主要供應(yīng)者

www.nci.nih.gov

提供有關(guān)細胞株的篩選

Cellsalive

www.cellsalive.com

生產(chǎn)各種細胞感染、

凋亡其它細胞過程的錄象和圖片

Gentest

www.gentest.com

藥物代謝試驗用的酶和肝細胞主要供應(yīng)者

ExpessionSystems

桿病毒細胞株的主要供應(yīng)者

LifeTechwww.lifetech.com

供應(yīng)基礎(chǔ)研究用的特異化細胞株

（4）組織（細胞）培養(yǎng)的局限性：

細胞（組織），包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴密聯(lián)系，不能代表整個機體。在進行醫(yī)學(xué)生物實驗過程及對結(jié)果的評估是都必須考慮這些。二．培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特點

(一)培養(yǎng)細胞的生長方式及類型1．貼壁生長型細胞：必須依附支持物的表面生存的一類細胞，這類細胞在體內(nèi)時多有一個依附的環(huán)境，形態(tài)附著方式也是多態(tài)性。上皮細胞型：這類細胞多來源于外胚層及內(nèi)胚層細胞。形態(tài)多為扁平的多角形，胞核位于中央圓形，細胞生長緊密，互相連接，多連成片狀。

成纖維細胞型：這類細胞起源于中胚層組織的細胞，體外生長時類似體內(nèi)，細胞呈梭型，不規(guī)則三角形，核為圓形，位于細胞質(zhì)中央，有長短不等的突起，生長特點是細胞不緊連成片，往往排列成旋渦狀、放射狀。2．懸浮生長型細胞：來源于血液、脾臟、或骨髓細胞，不依附任何支持物，懸浮于培養(yǎng)液中的單個或小的細胞團形式生長。（二）培養(yǎng)細胞的生長特點：

1．貼附（貼壁）：多數(shù)哺乳類動物在體內(nèi)都附著一定底物，或相互支持生長，體外培養(yǎng)同樣保持這種特性。他們在體外依附的底物可以是細胞、膠原，玻璃或塑料。未貼附前細胞多呈現(xiàn)圓形，一但貼附于底物即伸展呈纖維樣或上皮樣的細胞。

因此細胞貼壁一般需具備以下條件：

（1）底物：細胞、膠原、玻璃、塑料等。（2）促細胞貼附物質(zhì)：一般認為細胞貼附并非能量轉(zhuǎn)移過程，而且同電核有關(guān)。一般促貼附物質(zhì)（如基膜素，纖維連接蛋白，Ⅲ型膠原，血清擴展因子等），由于他們是蛋白質(zhì)，多存在于細胞膜表面，培養(yǎng)液或血清中，帶有陽電核，在培養(yǎng)過程中，他們先附在底物上，懸浮細胞再同它們接觸，吸住細胞并使其伸展成原來形態(tài)。（3）影響細胞貼附的因素：一定的鈣離子濃度，低鈣培養(yǎng)液不利細胞貼附；物理及機械因素，如底物的表面結(jié)構(gòu)，溫度，培養(yǎng)物的流動；生物因素亦可影響細胞貼附延伸。2．密度抑制（Densityinhibition）或接觸抑制（Ccontactinhibition）

1958年Abercrombie等學(xué)者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細胞再生長過程中多發(fā)生分裂增殖，細胞移動而相互靠近，這時某些細胞可移向其他方向，保證細胞不會重疊，一但接觸，這種活動即可停止。準確地說，所謂接觸抑制實際使細胞匯合形成單層時，細胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應(yīng)減少，營養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。（三）培養(yǎng)細胞的生長過程

1．細胞系生長過程（1）原代（初代）培養(yǎng)期：從機體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細胞保持異質(zhì)性，細胞種類較多，接近原組織細胞種類。維持時間，因細胞種類不同，一般1-4周。（2）傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長。一般正常二倍體細胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時可發(fā)生染色體丟失、突變、細胞增殖變慢、停止分裂，進入衰退期，我們稱之有限細胞系。這一轉(zhuǎn)折點有人稱之危象臨界點（crisis），有些細胞的少數(shù)后代，或通過人工條件轉(zhuǎn)化的細胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細胞系，或無限細胞系，即一般通稱的細胞系。（3）衰退期：傳代細胞到達一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐漸停止，進而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細胞（或叫有限細胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點），導(dǎo)致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說明生物學(xué)衰老的細胞學(xué)基礎(chǔ)。人胚胎成纖維細胞可以進行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細胞僅傳代了16代后便死亡。

當(dāng)然，對多細胞的生物來講，機體的衰老并不等于所有細胞的衰老，但細胞的衰老于機體的衰老卻是密切相關(guān)的。一般來說能保持繼續(xù)分裂的細胞不容易衰老；分化程度大，又不分裂的細胞壽命經(jīng)常是有限的。如表皮細胞壽命4-10天；紅細胞3周-3個月；白細胞5-7天，神經(jīng)細胞數(shù)年或更多。

體內(nèi)取出的細胞，體外傳代最多50-100代，除非發(fā)生突變（癌變），體內(nèi)一個胚細胞，其在機體發(fā)育過程中，分裂50-60次后必然要衰亡。細胞可能也在參與自身衰亡的過程，他們發(fā)現(xiàn)把老年動物血清加到培養(yǎng)基中，能很快促使細胞衰老，而用幼年動物的血清培養(yǎng)細胞時，可以延長細胞的壽命。2．細胞周期（細胞分裂周期）：簡言之，即是單個細胞的生長過程，即指母細胞分裂后形成的細胞到下一次再分裂成兩個子細胞之間的時期。是1953年，Howard和Pelc32P標記植物細胞后提出的。1957年形成氚（3H）標記，沿用至今。細胞的增殖是生物最根本的特征，細胞是借助于分裂來進行增殖的。通過細胞分裂可將復(fù)制的遺傳物質(zhì)平均地分配到兩個子細胞中。

我們進行體外細胞培養(yǎng)，實際是在細胞群體和個體的情況下考查細胞行為的。大部分細胞群體都由分裂和不分裂兩部分細胞混合組成。而不分裂細胞又可分為兩類：即保持再進入細胞周期能力的G0期細胞（或叫靜止細胞QuiescentCellsQ細胞，或休止細胞RestingCells)及不分裂最終注定要死亡的終止分化細胞（或稱之終端分化細胞），它們不能再進入周期。進入周期內(nèi)的細胞可以分為兩個期：間期（G1+S+G2）,M期（有絲分裂期），整個細胞周期組成是G1/0+S+G2M。（1）間期：

G1期：DNA合成前期或細胞分裂后期。這一期細胞代謝比較活躍，RNA，蛋白質(zhì)合成旺盛，為S期的DNA合成做好準備，此期后階段，中心體會進行分裂，為下一步復(fù)制提供條件，細胞體積在增大。這一期從細胞生理變化上有一個校正點（R點），由于各種內(nèi)外因素的影響，它可能控制G1期的延續(xù)時間變化，因此G1期的長短變化極大。S期：DNA合成期，此期結(jié)束DNA會加倍。早期復(fù)制的DNA富有G-C堿基，晚期復(fù)制的DNA富有A-T堿基。此期DNA合成的同時，也有組蛋白的合成。G2期：DNA合成后期，分裂前期。有活躍的RNA蛋白質(zhì)合成，DNA含量已加倍，有微管的合成，為M期，紡錘絲微管組裝提供原料。（2）M期：有絲分裂期。此期每個細胞將會分成兩個子細胞。顯微鏡下，可見處于分裂狀態(tài)的細胞，稱之分裂相，往往用細胞分裂指數(shù)來表示細胞群體增殖狀態(tài)。前期：此期的主要特征是染色質(zhì)濃縮，確定分裂極，核仁解體，核膜消失。DNA分子螺旋化和折疊，雙螺旋縮短，形成染色單體，進而變成雙結(jié)構(gòu)，中間有著絲粒相連。此時中心粒出現(xiàn)，周圍有微管形成的星體，逐漸分離，到相對應(yīng)位置形成細胞兩極。中心粒間的微管延長，形成紡錘體，染色體界于赤道部。中期：進入中期的染色體高度濃縮，形成典型中期染色體，部分紡錘體開始附著著絲粒上，染色體在赤道面上形成赤道板，此期細胞變成球體和培養(yǎng)皿接觸很小，震蕩可使其脫落，是收獲中期細胞的好機會。后期：染色體開始一分為二，幾乎所有的染色體同時分離，染色體被染色體絲拉向兩極，細胞也向兩極方向延長呈橢圓形，最后在赤道部凹下形成啞鈴狀。末期：染色體達到細胞兩極，開始解螺旋，并形成染色質(zhì)，核膜逐漸形成，核仁出現(xiàn)，胞體逐漸分離，形成兩個子細胞，兩個子細胞進入G1期。

完成一個細胞周期的時間，哺乳動物平均約10-30小時，其中S+G2M約為10小時，而G1期則因細胞種類，而差異較大。3．群體細胞的增殖過程：培養(yǎng)細胞，特別是傳代的單層培養(yǎng)細胞中，我們都可以認為是一混合的群體。每一代混合細胞群體，從接種開始到接種下一代，一般都經(jīng)過生長的三個階段，形成一標準的群體細胞生長曲線。圖5（1）遲緩期（或延遲期）：當(dāng)細胞接種到培養(yǎng)瓶后，細胞逐漸貼附于瓶底，并恢復(fù)貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現(xiàn)細胞分裂及增殖，但生長緩慢。（2）對數(shù)生長期：此期幾乎所有的細胞都在進行分裂，細胞數(shù)目迅速增長。期細胞倍增時間（TD）等于細胞周期時間（TC