第八章標(biāo)記

MethodsofLabelling

2023/7/27海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss1概念標(biāo)記：以共價(jià)鍵的方式將某些元素或化學(xué)基團(tuán)（標(biāo)記物）結(jié)合到生物分子中，成為示蹤復(fù)合物（探針），通過一定的方法顯示其存在的部位。探針：帶有標(biāo)記物的、感興趣的生物大分子或小分子，當(dāng)它們與相應(yīng)的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)（雜交），篩選得到確定的信息資料。標(biāo)記物：放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物、生色基團(tuán)、熒光物等。2023/7/272內(nèi)容提要第一節(jié) 核酸標(biāo)記第二節(jié) 蛋白質(zhì)（酶、抗體）標(biāo)記2023/7/273第一節(jié)核酸標(biāo)記（制備探針）核酸探針（probe）：能與特定核酸序列（靶序列）發(fā)生特異性互補(bǔ)（核酸）雜交，并含示蹤物的已知核酸片段(DNA或RNA)。因而可檢測樣品中特定的基因序列。2023/7/274根據(jù)核酸探針的來源及性質(zhì)有雙鏈DNA、單鏈DNA、單鏈RNA和人工合成的寡核苷酸探針等。用于分子雜交的核酸探針均須進(jìn)行標(biāo)記，帶有示蹤物，與靶基因雜交后，才能檢測顯示出雜交體信號(hào)。標(biāo)記物有放射性同位素和非放射性同位素兩大類。3H、35S和32P是三種較常用的放射性同位素標(biāo)記物，非放射性同位素標(biāo)記物較常用的是生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin，DIG）和熒光素等。

2023/7/275探針?biāo)鶖y帶的標(biāo)記物應(yīng)具備的條件：1.標(biāo)記后的探針的分子結(jié)構(gòu)要盡可能與原來的分子結(jié)構(gòu)相同，絕不影響其堿基配對(duì)特異性，不影響探針分子的主要理化特性，尤其是雜交特性。2.標(biāo)記探針的檢測方法簡便、省時(shí)、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高。3.穩(wěn)定性好、環(huán)境污染少、價(jià)廉。2023/7/276一、標(biāo)記物的制備及類型以標(biāo)記物分類：放射性同位素標(biāo)記（3H,14C,32P,35S,125I）非放射性同位素標(biāo)記（地高辛、生物素、酶、熒光素）以制備方法分類：雙鏈DNA探針標(biāo)記法；單鏈DNA探針標(biāo)記法；PCR合成DNA探針；寡聚核苷酸探針；RNA探針。2023/7/277標(biāo)記方法摻入法:即在DNA、RNA合成時(shí)，標(biāo)記物攜帶在單核苷酸上，作為合成的原料形式直接摻入進(jìn)去。方法分類：1.隨機(jī)引物法2.切口平移法3.cDNA合成法4.PCR法5.3’，5’末端寡聚核苷酸6.3’加poly(A)尾等方法。2023/7/2782023/7/279二、非核素標(biāo)記非放射性核素標(biāo)記都很容易摻入到DNA或RNA中制成核酸探針。使用的非放射性物質(zhì)主要是生物素、地高辛、熒光素。檢測方法主要有三種：化學(xué)發(fā)光法、生色法、熒光法。2023/7/27101.地高辛（digoxigeninDIG）是一種類固醇物質(zhì)，來源于洋地黃類植物。2023/7/2711DIG標(biāo)記是德國BoehringerMannheim公司發(fā)展的一種非放射性標(biāo)記方法。Digoxigenin-11dUTP可以通過隨機(jī)引物標(biāo)記結(jié)合到DNA探針或通過DNA體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記到RNA探針，或通過3′-尾端標(biāo)記結(jié)合到寡聚核苷酸探針。然后與抗地高辛抗體（anti-digoxigeninalkalinephosphatase）進(jìn)行免疫反應(yīng)，通過化學(xué)呈色檢測。2023/7/2712技術(shù)特點(diǎn)：與放射性標(biāo)記相比較，DIG系統(tǒng)具有以下多個(gè)優(yōu)勢：高靈敏度曝光時(shí)間短安全環(huán)保探針可重復(fù)使用可輕松進(jìn)行探針撥離和重探2023/7/27132.生物素將生物素（Biotin）連接在核酸探針上，利用親和素對(duì)生物素有極高親和力的原理，分子雜交后用親和素（Avidin）或鏈霉親和素（Streptavidin）進(jìn)行檢測。酶一底物顏色反應(yīng)檢測：親和素可以用酶（過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、熒光素或高電子密度（鐵蛋白、膠體金等）的標(biāo)志物標(biāo)記。生物素標(biāo)記探針穩(wěn)定，不失活，并能配用多種檢測系統(tǒng)，簡單方便。

2023/7/27142023/7/27153.分子信標(biāo)（分子燈塔探針）2023/7/2716三、核素標(biāo)記（一）核酸探針傳統(tǒng)的標(biāo)記物是用放射性同位素，多用32PdNTP、3HdNTP

、35SdNTP等。用放射性同位素標(biāo)記核酸有以下優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏性高2.特異性高

3.方法簡便2023/7/2717（二）放射性同位素標(biāo)記技術(shù)也存在以下缺點(diǎn)：1.半衰期短，必須經(jīng)常標(biāo)記探針2.費(fèi)用高3.檢測時(shí)間長4.放射性同位素對(duì)人體有害2023/7/27181.32P2.33P比32P使用安全。3.含35S的前體標(biāo)記物NTP或dNTP是借助以取代與磷酸共價(jià)相連的氧原子制成的。4.3H標(biāo)記的探針常用于原位雜交和核酸的合成和降解分析，與32P、35S、125I等比較，它的能量最低。（三）幾種常用放射性同位素比較2023/7/2719常用放射性核素的物理性質(zhì)核素半衰期100%純度時(shí)核素放射性活性(Specificactivity)(Ci/mmol)放射粒子的最大能量Emax(KeV)

3H12.4年

2918.5－14C5100年

62156－32P14.3天

91201710－35S87.1天

1490169－

125I60天

240034.634.5131I8.6天

161006083652023/7/2720

1.32P標(biāo)記在NTP或dNTP的磷酸位上。用放射自顯影或磷酸圖像儀檢測。Nucleotidelabeling2023/7/272132Por33P可取代dNTP或NTP不同磷酸位上的P原子，35S可取代核酸中磷酸分子上的一個(gè)O原子，3H取代H原子。dCMP2023/7/2722PdCMPSdCMPH2023/7/2723四、常用的探針標(biāo)記法1.雙鏈DNA探針標(biāo)記（1）隨機(jī)引物介導(dǎo)法（2）切口平移法2.單鏈DNA探針制備3.PCR合成DNA探針4.寡核苷酸探針的制備5.RNA探針的制備2023/7/27241.雙鏈DNA探針標(biāo)記

（1）隨機(jī)引物介導(dǎo)法隨機(jī)引物是6～12個(gè)核苷酸單鏈（來源于某種生物組織細(xì)胞的DNA降解小片段或人工合成的）。隨機(jī)引物與線性DNA模板雜交，在DNA聚合酶的催化下，從引物的3′末端開始按5′→3′方向合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈，如有[α-32P]dNTP或其他標(biāo)記物的摻入，就可產(chǎn)生標(biāo)記的DNA探針。見P182圖2023/7/2725

變性DNA加入隨機(jī)引物混合物(六核苷酸)和dNTP標(biāo)記混合物加入Klenow

片斷(無核酸外切酶活性)2023/7/2726Labellingprobesby“randompriming”DNA片斷熱變性5’5’3’3’加入隨機(jī)引物六核苷酸所有隨機(jī)組合有4096種2023/7/27275’3’5’3’3’3’5’5’加入DNA聚合酶dNTPs

其中一個(gè)是標(biāo)記的dNTP2023/7/2728[32P]dATP

通常用作放射性標(biāo)記的探針。放射自顯影檢測。地高辛(DIG)-dUTP通常用作非放射性標(biāo)記的探針。用酶聯(lián)抗地高辛抗體檢測。變性2023/7/2729[32P]dATP通常用作放射性標(biāo)記的探針。放射自顯影檢測b-particlesblackenX-rayfilmDNA固定在雜交膜上2023/7/27302023/7/2731（2）切口平移法（NickTranslation）原理及過程：當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶I可把核苷酸殘基加到切口處的3’羥基端。由于該酶具有5’→3’外切核酸酶活性，所以它可從切口的5’端除去核苷酸。5’端除去與3’端加入核苷酸同時(shí)進(jìn)行，導(dǎo)致切口沿著DNA模板鏈移動(dòng)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物中被標(biāo)記的單核苷酸被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。2023/7/2732

切口轉(zhuǎn)移2023/7/27332023/7/27342.單鏈DNA探針制備用DNA模板制備單鏈DNA探針的方法有：（1）合成可克隆于噬菌?；騇13噬菌體載體上的DNA為模板，合成與其序列互補(bǔ)的探針；需要分離探針與未標(biāo)記的核酸。（2）將克隆于特定載體上靶序列轉(zhuǎn)錄成RNA的探針。用不含有RNA酶的DNA酶Ⅰ極易除去模板DNA。2023/7/27352023/7/27363.PCR合成DNA探針在PCR循環(huán)過程，TagDNA聚合酶可將標(biāo)記的dNTP摻入DNA鏈中，用此法制備的探針靈敏度高，數(shù)量大。2023/7/2737PCR合成DNA探針Labelinginapolymerasechainreaction在PCR反應(yīng)里有用DIG-或32P-標(biāo)記了的dNTP:2023/7/27384.寡核苷酸探針的制備1）3’端寡核苷酸探針2）3’端尾部寡核苷酸探針3）5’端寡核苷酸探針2023/7/2739(a)

5′-pNpNp………NpNpN-OH-3′ DNAorRNAddA-p*-p-p

a-b-g末端轉(zhuǎn)移酶+α-32P-ddATP5′-pNpNpNpNp………Np

(a)

NpA-pA—pA－－H-3′3′-末端標(biāo)記（3′-

endlabelling）

(a)單鏈(DNAorRNA)標(biāo)記用末端轉(zhuǎn)移酶2023/7/27402023/7/27413′-末端標(biāo)記

(b)雙鏈DNA用DNA聚合酶2023/7/27425′-N………GGATCC……..N-3′ DNA3′-N………CCTAGG……..N-5′dA-p*-p-p

a-b-gDNA聚合酶+a-32P-dATP+dCTP,dGTP,dTTP5′-N………G-3′5′-GATCC……..N-3′3′-N………CCTAG-5′3′-G……..N-5′5′-N………GGATCGATCC……..N-3′3′-N………CCTAGCTAGG……..N-5′用BamHI

限制性內(nèi)切酶消化REDNA片斷3′-末端被標(biāo)記2023/7/27432023/7/27445′-末端標(biāo)記（5′-

endlabelling）是一個(gè)兩步反應(yīng);適用于RNA和雙鏈或單鏈DNA;堿性磷酸酶、T4噬菌體多核苷酸激酶和

g-32P-ATP;DNA5′末端的磷酸根，用堿性磷酸酶去磷酸化，再用T4多核苷酸激酶將[γ-32P]ATP的γ-32P轉(zhuǎn)移到DNA5′端的羥基上。2023/7/27455′-末端標(biāo)記5′-pNpNpNpNp………3′ DNAorRNA5′-*pNpNpNpNp………3′+A-p-p(ADP)T4多核苷酸激酶+g-32P-ATP堿性磷酸酶(egCIP)5′-NpNpNpNp………3′2023/7/27465.RNA探針的制備

體外轉(zhuǎn)錄對(duì)RNA的均勻標(biāo)記add

T7RNApolymerase

andNTPs

withone

a-32P-labelled先克隆合適的模板DNA到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄載體linearise

vectorinMCSdownstreamofinsertRNAmoleculeslinearDNAT7T32023/7/2747體外轉(zhuǎn)錄法2023/7/2748內(nèi)容提要第一節(jié) 核酸標(biāo)記第二節(jié) 蛋白質(zhì)（酶、抗體）標(biāo)記2023/7/2749第二節(jié)蛋白質(zhì)標(biāo)記抗體-抗原，酶-底物，激素-受體蛋白等特異性的反應(yīng)無法直觀表現(xiàn)與判斷，只有借助發(fā)色、發(fā)光試劑；或者同位素、酶試劑標(biāo)記產(chǎn)生高度專一性的探針，利用其作為靶標(biāo)，又能發(fā)出檢測信號(hào)的特點(diǎn)，提供判斷依據(jù)。2023/7/2750一、標(biāo)記方法1.酶標(biāo)記法2.熒光染料標(biāo)記3.生物素標(biāo)記4.金標(biāo)記5.同位素標(biāo)記2023/7/27511.酶標(biāo)記抗體IgG辣根過氧化酶，堿性磷酸酶，β－半乳糖苷酶與雙功能試劑戊二醛偶聯(lián)到抗體分子IgG，制成特異性探針。標(biāo)記物：酶2023/7/27522023/7/27532.熒光素染料標(biāo)記抗體熒光素、羅丹明、德克薩斯紅及異硫氰酸熒光素等物質(zhì)在堿性條件下與抗體分子IgG發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，根據(jù)熒光素特異波長及抗體蛋白波長之比值判斷其結(jié)合量。CyDye熒光染料直接標(biāo)記第二抗體，不需要反應(yīng)底物，直接掃描進(jìn)行篩選；或直接摻入DNA，可進(jìn)行核酸標(biāo)記。2023/7/27543.生物素標(biāo)記抗體2023/7/2755蛋白A-金顆粒復(fù)合物蛋白A-－直接結(jié)合到膠體金上，與免疫球蛋白有極高的親和作用。蛋白A金顆粒4.金標(biāo)記抗體2023/7/2756免疫膠體金的性質(zhì)免疫膠體金的反應(yīng)機(jī)制：膠體金是一種由極小的金顆粒組成的、帶負(fù)電荷的、疏水性的膠狀體。常用的是5～30nm。膠體金性能穩(wěn)定、對(duì)細(xì)胞無毒性、金顆粒形狀規(guī)則、電子密度高、便于觀察和分析。膠體金的金顆粒的直徑規(guī)格不同，所以能選擇差別較大的2～3種，對(duì)同一細(xì)胞中的不同種抗原進(jìn)行雙重或三重標(biāo)記，以便進(jìn)行抗原的定性和定位的比較研究。膠體金顆粒小，能提高標(biāo)記的準(zhǔn)確性，且容易滲透到細(xì)胞質(zhì)里，甚至細(xì)胞質(zhì)中的一些細(xì)胞器里。2023/7/2757免疫膠體金反應(yīng)機(jī)制膠體金與一抗(直接法)或二抗(間接法)結(jié)合，生成免疫抗體或抗抗體復(fù)合物，再與細(xì)胞中相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成抗原與膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體復(fù)合物。利用金顆粒的電子密度高，電鏡下檢測到的金顆粒存在的部位，即是所探求的抗原在細(xì)胞中的定位。另外通過分析金顆粒的相對(duì)密度的高低，還能進(jìn)行半定量的研究。2023/7/2758免疫膠體金反應(yīng)2023/7/2759二、標(biāo)記物的純化萃取－沉淀（有機(jī)溶劑的選擇性沉淀）層析法（凝膠過濾、離子交換、吸附、親和層析）離心分離電泳分離2023/7/2760三、探針的鑒定雜交法酸沉淀法層析法比色法發(fā)光法電子顯微鏡觀察2023/7/2761放射性同位素標(biāo)記探針：放射自顯影。非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針：偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)。2023/7/27622023/7/27631.雜交法

此法通常是由印跡、雜交和檢測分析等步驟組成。分子雜交：標(biāo)記的探針DNA變性后與變性后的靶DNA/RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，形成雜種分子的過程。

分子雜交包括：DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交及蛋白雜交等。

分子雜交的目的就是運(yùn)用特異的探針鑒定復(fù)雜的靶DNA中同源的DNA片段。2023/7/2764Southernblot

1975年，英國科學(xué)家Southern首創(chuàng)，是指DNA-DNA雜交，是經(jīng)典的基因分析方法。

原理和步驟:

提取DNA

限制酶消化DNA片段電泳分離變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜變性、雜交洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析2023/7/27652023/7/2766斑點(diǎn)雜交(dotandslothybridization)

鑒定核酸序列的簡便方法。原理及步驟：提取CellDNA

↓

點(diǎn)樣品至膜、干燥、固定

↓

探針、DNA變性、雜交

↓

洗膜、放射自顯影

↓

結(jié)果分析

2023/7/2767Northernblot

是指RNA印跡法，應(yīng)用特異性基因探針分析基因的轉(zhuǎn)錄水平。原理及步驟：提取Cell總RNA↓

提純分離mRNA

↓

瓊脂糖凝膠電泳分離RNA↓

轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜

↓

雜交檢測2023/7/2768Western

雜交印跡法(Westernbloting)檢測蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法。主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：NC膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測靶蛋白于第一抗