PCR引物設計及相關軟件使用PCR引物設計及相關軟件使用主要內容背景PCR引物設計原則常用PCR引物設計軟件PrimerPremier5.0介紹Oligo6.22介紹在線Primer3介紹主要內容背景PCR聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaPCR引物設計引物設計是PCR技術中至關重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導致實驗失?。罕憩F為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行。可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業(yè)軟件。PCR引物設計引物設計是PCR技術中至關重要的一環(huán)。使用不引物設計的原則引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(即錯配)。引物設計的原則引物與模板的序列要緊密互補如引物長度（primerlength），產物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結構（duplexformationandhairpin）的能值，在錯配位點（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。具體因素如引物長度（primerlength），產物長度（prod一般原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應大于38。引物過短又同時會引起錯配現象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（不容易引起錯配）。例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3x109/412=200).而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個.較長的引物（28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產生一些突變位點一般原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-24Tm值的計算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

對于長一些的引物可用更為準確的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）Tm值的計算一般原則2.引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

一般原則2.引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’一般原則3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。一般原則3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G值相對較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA聚合反應。（能值越高越容易結合）一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值一般原則6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。

一般原則6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據一般原則7.引物二級結構對PCR反應的影響。盡可能少的引物二聚體。

一般原則7.引物二級結構對PCR反應的影響。常用的引物設計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier（自動搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務）*常用的引物設計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能:1、即引物設計2、限制性內切酶位點分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能簡并引物設計根據氨基酸序列來設計引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）2、無脊椎動物線粒體（InvertebrateMitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（PlantMitochondrion）5、原生動物線粒體（ProtozoanMitochondrion）6、一般標準（Standard）7、脊椎動物線粒體（VertebrateMitochondrion）8、酵母線粒體（YeastMitochondrion）簡并引物設計根據氨基酸序列來設計引物DNA引物PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動界面LoadsequencePrimerPremier5.0使用介紹(1)Preim基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction基本信息SequencenameOriginalsequ引物設計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物設計界面Firstyoucandesignthe引物搜索選項設定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產物大小范圍引物長度引物搜索選項設定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置搜索結果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物搜索結果28對引物引物分值每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產物信息是否出現hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物信息回到主窗口引物及產物信息是否出現hairpin,di一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最引物編輯引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow引物編輯EditprimerhereAnalysistSomeotherusefulfunctionofPP5SomeotherusefulfunctionofEnzymeEnzymeMeltingtemperaturegraphPer25-merMeltingtemperaturegraphPer2GC%graphPer25-merGC%graphPer25-merStabilityPer5-merStabilityPer5-merOligo6.44使用說明主要功能：專門的引物設計軟件Oligo6.44使用說明主要功能：專門的引物設計軟件Oligo6.44啟動界面OpensequencefileOligo6.44啟動界面Opensequencef3個彈出窗口Meltingtemperature3個彈出窗口Meltingtemperature?GInternalStability?GInternalStabilityFrq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數據庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。Frq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數據庫文件中用Oligo設計引物時的3個標準Tm值曲線以選取5’到3’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低用Oligo設計引物時的3個標準Tm值曲線以選取5’到3引物設計-初學者超級推薦課件選中引物上游引物下游引物只是示意圖選中引物上游引物下游引物只是示意圖引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。引物分析二項檢查是發(fā)夾結構（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結構的能值越低越好。引物分析二項檢查是發(fā)夾結構（hairpin）；與二聚體相同，引物分析第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜。第四Falsepriming檢查引物分析第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜。引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC