第三章免疫酶組織化學(xué)技術(shù)第三章1免疫酶組織化學(xué)技術(shù)酶辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶.酶標(biāo)記已知Ab(或Ag)+組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的Ag(或Ab)抗原抗體復(fù)合物(酶標(biāo))底物有色沉淀定位;圖像分析儀半定量免疫酶組織化學(xué)技術(shù)2免疫組化方法酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)直接法間接法◆非酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)酶橋法PAP法、APAAP法免疫組化方法3酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法(一)原理直接法和間接法直接法是將酶標(biāo)記在第一抗體上,直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特異性抗原。間接法一兩步法抗:是細(xì)胞組織內(nèi)抗原的特異性抗體;二抗:是抗一抗的抗體,并且已用酶標(biāo)記(注意:第二抗體與第一抗體須是不同種屬動(dòng)物制備的,因?yàn)榈诙贵w往往是用第一種動(dòng)物的IgG所制備。)酶標(biāo)抗體免疫組織化學(xué)染色法4酶標(biāo)抗體法-直接法原理:將酶直接標(biāo)記在一抗上過氧化粉然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成抗原一抗體_酶復(fù)合物,最后用底物顯色劑顯色第一體優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)非特異性背景反應(yīng)低缺點(diǎn):浪費(fèi)抗體、敏感性極低圍》1兔組化直法依靠化學(xué)連接(共價(jià)鍵)對(duì)酶及抗體活性有影響。每種抗原必須分別用其抗體的酶標(biāo)記物。酶標(biāo)抗體法-直接法5酶標(biāo)抗體法-間接法二抗原理:將酶標(biāo)記在二抗上,先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合,形成抗過化原抗體復(fù)合物,再用二抗(酶標(biāo)抗體)與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合,第一抗形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物最后用底物顯色劑顯色優(yōu)點(diǎn):只需一種酶標(biāo)抗體即可?！鳌饕籱E塊:教感性低,但優(yōu)于直接法圍22免疫組化國(guó)接法依靠化學(xué)連接對(duì)酶及抗體活性有影響。酶標(biāo)抗體法-間接法6令免疫酶組織化學(xué)方法最終的生成物是帶有酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物,再依據(jù)酶與底物作用生成不溶性的有色產(chǎn)物沉積在抗原抗體反應(yīng)原位,并借此確定該抗原的性質(zhì)、存在的部位和含量。令顯色反應(yīng):令酶+底物=不溶性的色素標(biāo)記酶:辣根過氧化物酶(HRP)堿性磷酸酶(ALP)葡萄糖氧化酶(GOD)β-D-半乳糖苷酶.令免疫酶組織化學(xué)方法最終的生成物是帶有酶標(biāo)記71辣根過氧化物酶HRP顯色:產(chǎn)物棕褐色HRP與底物過氧化氫和DAB作用產(chǎn)物棕褐色,有嗜鋨性DAB性質(zhì):電子供體,較敏感,室溫時(shí)較穩(wěn)定,顯色后切片可長(zhǎng)期保存?？芍掳?可將DAB制成10倍濃度儲(chǔ)存液,分裝后-20℃貯存注意事項(xiàng):孵育時(shí)間和配置方式易產(chǎn)生背景著色濃縮的DAB—按照說(shuō)明書;注意校正蒸餾水的PH值;粉劑DAB—溶解時(shí)濾去不溶性顆粒;現(xiàn)用現(xiàn)配保存時(shí)可產(chǎn)生氧化物沉積在切片上,形成斑點(diǎn)。臨用前加H2O21辣根過氧化物酶HRP81辣根過氧化物酶HRP:3344491辣根過氧化物酶HRP:92堿性磷酸酶ALP顯色:產(chǎn)物藍(lán)色或紅色令以磷酸萘酚ASMX為底物,被ALP水解后生成萘酚AS-MX,再與孵育液內(nèi)的堅(jiān)牢藍(lán)B鹽或堅(jiān)牢紅TR鹽等偶聯(lián)生成不溶性染料(堅(jiān)牢藍(lán)或堅(jiān)牢紅)而成令優(yōu)點(diǎn):細(xì)胞和組織內(nèi)的內(nèi)源性堿性磷酸酶很容易被抑制和破壞,而不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性酶顯色,從而提高特異性。令缺點(diǎn):顯色彌散,不如過氧化物酶系統(tǒng)的清晰和明確2堿性磷酸酶ALP10免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件11免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件12免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件13免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件14免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件15免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件16免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件17免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件18免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件19免疫酶組織化學(xué)技術(shù)課件