雙黃連方藥抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究目的:雙黃連方藥由金銀花、連翹、黃芩配伍而成,是目前臨床治療呼吸道感染性疾病的代表方劑之一療效顯著有三十多年臨床用藥歷史在禽流感、等烈性呼吸道傳染性疾病的治療中也發(fā)揮了重要作用,具有清熱解毒,清宣透散之功,現(xiàn)代藥理研究表明雙黃連方藥具有廣譜抗病毒和抗菌效果,但雙黃連的抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不夠充分,制約了該方藥的二次開(kāi)發(fā),闡明該方藥的抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)仍是雙黃連方藥繼續(xù)向前發(fā)展的關(guān)鍵所在。方法:（1）高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法全面分析雙黃連粉針劑及其各組成藥材提取物中化學(xué)成分,對(duì)其進(jìn)行初步的定性分析并對(duì)其藥味來(lái)源進(jìn)行歸屬。雙黃連粉針為哈爾濱中藥二廠(chǎng)生產(chǎn),各組成藥材按200版5中國(guó)藥典中雙黃連口服液工藝進(jìn)行提取液質(zhì)聯(lián)用條件為色譜柱柱（x 18流動(dòng)相A 醋酸水溶液）（甲醇）梯度洗脫? （f） f（） ? C0流速 進(jìn)樣量M檢測(cè)波長(zhǎng) 。質(zhì)譜條件電噴霧電離源（源）碰撞能干燥氣溫度°C干燥氣流速 霧化氣壓力負(fù)離子掃描掃描范圍 ?。將各供試液上機(jī)分析,對(duì)各色譜峰的質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行分析,對(duì)化合物進(jìn)行初步定性。（2）優(yōu)選大孔樹(shù)脂對(duì)雙黃連方藥的組成藥材金銀花、連翹進(jìn)行大孔樹(shù)脂分離,并對(duì)各提取分離部位化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。（3）以陽(yáng)性藥物利巴韋林注射液作為對(duì)照,對(duì)各提取分離部位進(jìn)行體外抗呼吸道合胞病毒活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)重復(fù)次。藥物毒性實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng),待長(zhǎng)滿(mǎn)后用胰酶消化,含10小%牛血清的培養(yǎng),待長(zhǎng)滿(mǎn)后用胰酶消化,含10小%牛血清的培1養(yǎng)6液4制0成細(xì)胞懸液以X個(gè) 的細(xì)胞密度加入孔板中每孔JC孵相中培養(yǎng) 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層。等體積2%小牛血清的細(xì)胞維持液。吸出培養(yǎng)液加入各濃度藥液 M每個(gè)濃度個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照只加入7每小時(shí)觀(guān)察細(xì)胞病變情況（）孵箱中培養(yǎng)連續(xù)觀(guān)察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。后將藥液吸出每孔加入（用配制）°C孵箱中孵育后棄上清每孔加入室錄0連續(xù)觀(guān)察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。后將藥液吸出每孔加入（用配制）°C孵箱中孵育后棄上清每孔加入室錄0溫下振蕩混勻下酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。采用1統(tǒng)3計(jì).軟采用1統(tǒng)3計(jì).軟0件回歸將藥物濃度與細(xì)胞存活率進(jìn)行回歸分析,計(jì)算細(xì)胞半數(shù)存活濃度。呼吸道合胞病毒））毒力測(cè)定:采用微5毒力測(cè)定:采用微5量0法＜用/公式計(jì)算藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)方法:藥物在無(wú)毒濃度范圍內(nèi)錄用含2小%牛血清的細(xì)胞維持液對(duì)藥物進(jìn)行倍比稀釋加入病毒液使病毒濃度為混勻陽(yáng)性對(duì)照藥為利巴韋林注射液（）用細(xì)胞維持液稀釋并加入病毒液使利巴韋林終濃度為|J病毒終濃度為于7孵箱中孵育。已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的孔板吸掉培養(yǎng)液每孔接種J各濃度藥液與病毒的混合液每個(gè)濃度個(gè)復(fù)孔同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組病毒對(duì)照組和正常對(duì)照組C培養(yǎng)后將藥物組和病毒組液體吸出加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)每日觀(guān)察。后記將藥液吸出錄每孔加入l后記將藥液吸出錄每孔加入l用配制）J溫下振蕩混勻在下酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度值。并計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率。采用 統(tǒng)計(jì)軟件 回歸將藥物濃度與病毒抑制率進(jìn)行回歸分析計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度 。并計(jì)算治療指數(shù)。采用 統(tǒng)計(jì)軟件 對(duì)各藥物不同濃度組、陽(yáng)性對(duì)照組、病毒對(duì)照組、正常對(duì)照組間吸光度均數(shù)進(jìn)行方差分析及組間多重比較,確定各藥物組間及其與對(duì)照組間病毒抑制率是否有顯著性差異。（4）通過(guò)分析抗病毒活性部位成分、對(duì)比其與雙黃連粉針中化學(xué)成分差異尋找相關(guān)抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果:（1）對(duì)雙黃連粉針及各藥材提取物中各色譜峰的質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行分析,推斷化合物分子量,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照、譜圖中碎片離子結(jié)構(gòu)分析及文獻(xiàn)查閱,從雙黃連粉針中共檢測(cè)出30個(gè)色譜峰,其中鑒定了26個(gè)化學(xué)成分;從金銀花提取物中檢測(cè)出21個(gè)色譜峰,鑒定了18個(gè)化學(xué)成分;從連翹提取物中檢測(cè)出23個(gè)色譜峰,鑒定了11個(gè)化學(xué)成分;從黃芩提取物中檢測(cè)出5個(gè)色譜峰,鑒定了4個(gè)化學(xué)成分;從金銀花連翹合煎提取物中檢測(cè)出24個(gè)色譜峰,鑒定了22個(gè)化學(xué)成分。（2）通過(guò)各譜圖間的比較對(duì)雙黃連粉針中各色譜峰進(jìn)行藥味歸屬。雙黃連粉針總離子流圖中共檢測(cè)到30個(gè)色譜峰,其中14個(gè)峰來(lái)自金銀花,主要為綠原酸、異綠原酸及其同分異構(gòu)體等化合物;1個(gè)0峰來(lái)自連翹,主要為連翹酯苷及其同分異構(gòu)體等化合物;5個(gè)峰來(lái)自黃芩,主要為黃芩苷等黃酮類(lèi)化合物;另有4個(gè)峰從各藥味中找不到歸屬,推測(cè)可能與以下因素有關(guān):中藥材的化學(xué)成分與產(chǎn)地及季節(jié)有一定的依賴(lài)關(guān)系,實(shí)驗(yàn)所用的3個(gè)藥材,與雙黃連粉針生產(chǎn)廠(chǎng)所用原料,雖然品種一致,但來(lái)源不同,因此在成分上可能存在差異;是生產(chǎn)過(guò)程中化合物間的相互作用或分解等產(chǎn)生的新的化合物。對(duì)比金銀花提取物,連翹提取物,及金銀花連翹合煎提取物的總離子流圖,發(fā)現(xiàn)金銀花單煎提取物中有4個(gè)綠原酸的同分異構(gòu)體,而金銀花連翹合煎只有2個(gè)綠原酸的同分異構(gòu)體,推測(cè)可能是綠原酸在合煎條件下比單煎穩(wěn)定,連翹單煎提取物中的3、4、5、6,1號(hào)峰在金銀花連翹合煎提取物中不明顯,說(shuō)明金銀花連翹合煎與兩藥材單煎在物質(zhì)基礎(chǔ)上存在一定差異。對(duì)比連翹提取物、金銀花連翹合煎提取物及雙黃連粉針的總離子流圖,發(fā)現(xiàn)連翹提取物中的9,1號(hào)0峰在雙黃連粉針中消失,但在金銀花連翹合煎提取物中能找到這兩個(gè)峰的歸屬,說(shuō)明這兩個(gè)峰的消失應(yīng)該與雙黃連粉針進(jìn)一步的生產(chǎn)制備工藝有關(guān)。兩個(gè)峰 。離子均為 推測(cè)其應(yīng)該是連翹酯苷及其同分異構(gòu)體0考察其分子結(jié)構(gòu)比連翹酯苷多一個(gè)羥基可能失去一分子水并發(fā)生雙鍵還原反應(yīng) 而變成在雙黃連粉針中號(hào)峰 離子為 為連翹酯苷的同分異構(gòu)體且從各單味藥中找不到歸屬是否由連翹酯苷反應(yīng)得來(lái)需進(jìn)一步驗(yàn)證雙黃連粉針中號(hào)峰 為 響應(yīng)值較高推測(cè)其為連翹酯苷在連翹提取物中能找到對(duì)應(yīng)峰但連翹提取物中的 響應(yīng)值較低本研究認(rèn)為如果是連翹中已含有的連翹酯苷在雙黃連粉針中的響應(yīng)值不應(yīng)該明顯增大測(cè)考慮到連翹酯苷分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定測(cè)容易失去一個(gè)咖啡?；玫竭B翹酯苷 因此推測(cè)雙黃連粉針中的峰的顯著增大可能由連翹酯苷失去咖啡?；?。（）通過(guò)以上各譜圖間的對(duì)比分析及對(duì)各色譜峰的初步定性測(cè)可以看出雙黃連粉針是一個(gè)非常復(fù)雜的化合物組群,其中許多化合物均以同系物或同分異構(gòu)體的形式存在,首次確定了雙黃連粉針中綠原酸類(lèi)化合物有3個(gè)單咖啡?？崴岬耐之悩?gòu)體（4,7號(hào),峰）和3個(gè)雙咖啡?？崴岬耐之悩?gòu)體（17,18號(hào),峰2）2;首次檢測(cè)出雙黃連粉針中同時(shí)存在著連翹酯苷（為）的個(gè)同分異構(gòu)體（ 號(hào)峰）都有相同的碎片離子 推測(cè)其由 脫咖啡?；脕?lái)。其中13和18號(hào)峰可以在單味連翹提取物及金銀花連翹合煎提取物中找到歸屬目前文獻(xiàn)報(bào)道的連翹中分子量為的苯乙醇苷只有連翹酯苷和阿克替苷（ ）兩個(gè)（兩個(gè)化合物具有相同的母核和取代基但取代基位置不同）經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照確定號(hào)峰為連翹酯苷因此號(hào)峰應(yīng)為阿克替苷。號(hào)峰則不能從上述組成藥材中找到歸屬是否由連翹酯苷反應(yīng)得來(lái)需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。中藥理論認(rèn)為中藥中通常存在一類(lèi)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物因共同發(fā)揮藥效作用因從此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確認(rèn)中藥中確實(shí)存在著這樣的結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物群。同時(shí)可以看到全方化學(xué)成分絕非各單味藥材化學(xué)成分的簡(jiǎn)單疊加因在生產(chǎn)過(guò)程中因受到工藝條件、化合物間相互作用等各種因素的影響通常有新的化合物產(chǎn)生。在雙黃連粉針、金銀花提取物及金銀花連翹合煎提取物中均存在一個(gè)響應(yīng)值很高的 峰（號(hào)峰）經(jīng)理論推斷和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照證實(shí)其為奎尼酸為首次報(bào)道雙黃連粉針中存在奎尼酸,奎尼酸應(yīng)該不是來(lái)自綠原酸的水解,而是來(lái)源于金銀花。（）經(jīng)大孔樹(shù)脂分離金銀花得到個(gè)分離部位A、各部位成分基本無(wú)重疊其中部位主要為綠原酸及其同分異構(gòu)體等成分部位主要為異綠原酸及其同分異構(gòu)體等成分部位分子量相對(duì)較大尚未鑒定出為哪些成分。連翹得到個(gè)分離部位A、、、C各部位成分無(wú)重疊其中A部位成

分未能鑒定B部位主要為連翹酯苷及其同分異構(gòu)體、蘆丁等成分部位成分未能鑒定。（5）對(duì)各分離部位、黃芩精制物、雙黃連粉針等共10個(gè)藥物進(jìn)行體外抗呼吸道合胞病毒活性篩選結(jié)果金銀花部位表現(xiàn)出較好的抗病毒活性 治療指數(shù)部位抗病毒活性較弱治療指數(shù) 部位未表現(xiàn)出抗病毒活性連翹A部位抗病毒活性較弱 治療指數(shù).部位表現(xiàn)出很好的抗病毒活性?xún)?yōu)于陽(yáng)性藥物 治療指數(shù)8部位表現(xiàn)出很好的抗病毒活性 治療指數(shù)黃芩精制物表現(xiàn)出較好的抗病毒活性 治療指數(shù)雙黃連粉針表現(xiàn)出很好的抗病毒活性 治療指數(shù)O結(jié)論:雙黃連方藥的抗病毒效果應(yīng)歸功于多成分的協(xié)同作用,其中金銀花的分離部位、連翹的B、出部位黃芩精制部位均具有很好的抗病毒活性各部位化學(xué)成分研究表明,主要活性成分為奎尼酸、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、番木鱉酸、