農(nóng)業(yè)行業(yè)標準制修訂項目《天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法》標準制定編制說明項目名稱：天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法項目序號：14202184提出單位：中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局歸口單位：全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會（SAC/TC76）起草單位：中國農(nóng)業(yè)大學、全國畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心、青島農(nóng)業(yè)大學主要起草人：郝智慧、高雪嫣、李燕松、戰(zhàn)余銘、單麗燕、劉暢、唐啟和實施時間：

目 次1工作簡況

天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法1工作簡況1.1任務來源本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出，計劃編號為“14202184”，中國農(nóng)業(yè)大學、全國畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心、青島農(nóng)業(yè)大學承擔并組織相關(guān)技術(shù)人員對《天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法》進行了編制。1.2制定背景在畜禽飼料“禁抗令”全面實行的背景下，天然植物飼料原料成為了提高生長性能、替抗的重要選擇。天然植物作為飼料使用在我國有著悠久的歷史，我國古代勞動人民在長期飼養(yǎng)畜禽的過程中，積累總結(jié)了大量經(jīng)驗?？娠曈锰烊恢参飦碓从诖笞匀?，具有天然性、多功能性和毒副作用小等特點，近年來被大量開發(fā)作為飼用抗生素替代品，應用對象從雞、豬、牛、羊、犬、貓、兔等畜禽逐漸拓寬到水產(chǎn)動物和特種經(jīng)濟動物；應用目的包括補充營養(yǎng)成分、提高飼料利用率、增加動物產(chǎn)品產(chǎn)量、改善動物產(chǎn)品質(zhì)量和飼料品質(zhì)等方面。但天然植物飼料原料沒有統(tǒng)一標準，質(zhì)量參差不齊，規(guī)范天然植物飼料原料的質(zhì)量要求亟待解決。我國在農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第1773號公告《飼料原料目錄》中規(guī)定了117種可飼用天然植物原料，這117種天然植物可以以單一、復配或混合的形式進行直接添加使用。甘草（Glyeyrrhiza）為“豆科甘草屬植物甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）、脹果甘草（GlycyrrhizainflataBatal.）或洋甘草（GlycyrrhizaglabraL.）的干燥根和根莖”，是重要的可飼用天然植物原料品種。目前，以甘草為單一或復配的天然植物飼用原料產(chǎn)品較為普遍。有研究表明，甘草飼料原料能夠有效提高羊的生產(chǎn)性能[1]、提高斷奶仔豬的抗病力[2]、促進大黃魚生長[3]、遏制肉雞體內(nèi)有害菌群的繁殖[4]、減少反芻動物胃黏膜的損傷[5-6]等。同時甘草具有調(diào)和諸藥之功效，使得天然植物飼料原料甘草在天然植物原料中廣泛應用。甘草主產(chǎn)于內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅、新疆等地，東北、陜西、青海、河北、山西等地亦產(chǎn)。甘草中含有甘草酸、甘草次酸等三萜及其皂苷類成分，同時含有甘草素、異甘草素、新異甘草苷等黃酮類成分。由于其明顯的種屬、地域、生長環(huán)境等差別，造成甘草中的有效成分及含量具有顯著的差異。目前，市場上，以甘草及其提取物作為飼料原料的產(chǎn)品種類繁多，甘草列入《飼料原料目錄》而未列入其第四部分《單一飼料品種》，因此，甘草的生產(chǎn)、經(jīng)營無需辦理《飼料生產(chǎn)許可證》，應符合《飼料衛(wèi)生標準》、《飼料標簽》等強制性標準的要求。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)400余家生產(chǎn)飼料原料的企業(yè)，不同企業(yè)之間的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制標準千差萬別，尚缺乏統(tǒng)一的標準，造成市場上甘草可飼用植物原料的質(zhì)量參差不齊，非常不利于飼料添加劑質(zhì)量安全監(jiān)管、養(yǎng)殖業(yè)安全使用。目前我國沒有檢測可飼用天然植物原料甘草的相關(guān)標準發(fā)布。國內(nèi)已發(fā)表的有關(guān)于甘草的標準為“GB/T19618—2004甘草”，該標準規(guī)范了甘草為“豆科甘草屬植物甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）、脹果甘草（GlycyrrhizainflataBatal.）及光果甘草（GlycyrrhizaglabraL.）干燥根及根莖的加工產(chǎn)品”，“內(nèi)在質(zhì)量檢查”項規(guī)定了甘草主要指標成分“甘草酸”的測定方法。甘草酸（GlycyrrhizicAcid）是衡量甘草質(zhì)量的關(guān)鍵指標。同時，甘草酸也是甘草中最主要的活性成分[7]。如表2所示，在甘草、甘草提取物或含甘草藥物的研究中，均是以甘草酸作為指標成分進行質(zhì)量控制。文獻名指標成分HPLC測定甘草提取物中甘草酸的含量甘草酸HPLC測定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量甘草酸HPLC法測定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量甘草酸HPLC法測定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量甘草酸甘草酸鉍散的質(zhì)量標準研究甘草酸高效液相色譜法測定清肺顆粒中甘草酸的含量甘草酸經(jīng)典名方溫經(jīng)湯標準湯劑HPLC指紋圖譜建立及9種成分含量測定甘草酸利尿合劑的質(zhì)量標準分析甘草酸UPLC-MS/MS法同時檢測參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量甘草酸考慮到飼料行業(yè)的整體情況和作為飼料原料的產(chǎn)品屬性，我們選擇了甘草酸作為指標成分對可飼用天然植物原料中的甘草質(zhì)量進行質(zhì)量控制。目前國內(nèi)已發(fā)表的國家及行業(yè)標準涉及甘草酸的標準主要有GB/T22248—2008保健食品中甘草酸的測定[8]、SN/T3854—2014出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測定高效液相色譜法[9]。在《中國藥典》2000年版和《中國獸藥典》2000年版中甘草酸作為甘草含量測定的單一指標成分，此后的《中國藥典》和《中國獸藥典》增加了甘草苷和甘草酸共同作為甘草含量測定項，均為高效液相色譜法。隨著天然植物飼料原料在飼料中的普遍應用，甘草酸作為主要的活性指標成分之一，尚未制定天然植物飼料原料中甘草酸通用的標準測定方法，高效液相色譜法是目前更適合產(chǎn)業(yè)實際并且具有簡單、快速，且靈敏度高特點。建立一種高效、靈敏、便捷的檢測方法作為指導一線檢測重要活性成分指標甘草酸，是指導使用天然植物飼料原料和安全使用提供有力手段。本團隊前期通過收集和監(jiān)測分析大批量的甘草可飼用植物原料和相關(guān)含甘草的飼料原料樣品，通過對這些樣品進行含量測定，也確定了以甘草酸為指標成分建立天然植物飼料原料中甘草酸高效液相色譜法，能夠更加科學合理的建立含甘草的天然植物飼料原料產(chǎn)品標準和質(zhì)量控制。表SEQ表\*ARABIC1國內(nèi)外甘草相關(guān)的標準匯總序號標準編號標準名稱檢測對象檢測方法1GB/T19618—2004甘草甘草酸高效液相色譜法2GB/T22248—2008保健食品中甘草酸的測定甘草酸高效液相色譜法3SN/T3854—2014出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測定高效液相色譜法甘草酸高效液相色譜法因此，針對上述產(chǎn)業(yè)實際需求，針對天然植物飼料原料的不同產(chǎn)品形式，如干燥物、粉碎物和粗提取物產(chǎn)品形式，及單一型和復配型產(chǎn)品中甘草酸的高效液相檢測方法進行建立，明確色譜工作條件和參數(shù)，并對檢測方法的靈敏度、準確度和精密度進行確定。擬制定《天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法》方法標準，規(guī)定作為可飼用天然植物原料使用的甘草的主要指標成分甘草酸的質(zhì)量控制指標和檢測方法，利用該法完成天然植物飼料原料中甘草酸的檢測，實現(xiàn)天然植物飼料原料質(zhì)量的規(guī)范化。這對規(guī)范天然植物原料生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)，保護畜禽養(yǎng)殖企業(yè)的利益和促進我國可飼用天然植物原料產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重大的現(xiàn)實意義。1.3起草過程及內(nèi)容1.3.1起草過程2020年8月，中國農(nóng)業(yè)大學、全國畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心、青島農(nóng)業(yè)大學接到了農(nóng)業(yè)行業(yè)標準制定的任務后，成立了標準編制小組，主要由從事標準制修訂、儀器分析、具有豐富技術(shù)經(jīng)驗的專業(yè)研究人員組成。2020年9月，中國農(nóng)業(yè)大學組織了有關(guān)的專家、主要標準起草人員召開了行業(yè)標準《天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法》編制項目的啟動會，就《天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法》的國內(nèi)外標準、檢測方法研究進展、項目的主要工作內(nèi)容、技術(shù)路線等進行了探討，認真分析了技術(shù)方案的可行性，并結(jié)合國內(nèi)外發(fā)展趨勢、當前行業(yè)存在的技術(shù)問題展開討論，確定了該標準制定的技術(shù)路線、技術(shù)內(nèi)容、分工以及時限要求等。確定了標準制定的技術(shù)路線和方案制定。2020年10月至2021年09月，標準編制小組在有關(guān)質(zhì)量檢測的基礎上，廣泛查閱國內(nèi)外研究的文獻資料、標準和其他權(quán)威部門出版物，主要參考《中國獸藥典》二〇〇五版二部[10]中的樣品前處理及高效液相檢測方法開展研究。標準編制小組購買標準品、試劑以及采集代表性的含甘草的單一型、混合型和復配型飼料原料樣品，開展了樣品前處理、色譜分離條件優(yōu)化、儀器條件優(yōu)化等工作，對建立的方法進行了實驗室內(nèi)部的方法學驗證，包括準確性、精密度、穩(wěn)定性以及樣品適用性等，隨后測定實際樣品，對試驗數(shù)據(jù)進行了匯總分析。結(jié)合我國天然植物飼料原料質(zhì)量標準的實際情況，對相關(guān)研究成果進行全面評價，制定《天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法》標準草案，形成征求意見稿。2021年10月至2022年6月，標準編制小組選擇了三家質(zhì)檢機構(gòu)，對標準文本進行了驗證，并征求了驗證單位意見，根據(jù)專家意見進行了標準文本和編制說明的修改完善。完成了標準草案及編制說明的編寫和實驗室間驗證。同時以函審的方式廣泛征求相關(guān)科研院所的專家和有關(guān)企業(yè)技術(shù)人員的意見，通過意見反饋，進行修改和完善，形成預審稿。2022年11月至2022年12月，組織專家評審，進行會議審核，再次討論和征求專家意見，并進行相應的修改完善，最后形成送審稿，報全國飼料標準化技術(shù)委員會。2023年3月1日，全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會微生物及酶制劑標準化工作組組織專家對中國農(nóng)業(yè)大學等單位起草的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法》（預審稿）進行審查。2023年3月至2023年5月，根據(jù)全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會微生物及酶制劑標準化工作組專家建議對標準和編制說明進行修改完善，形成公開征求意見稿。圖SEQ圖\*ARABIC1標準編制的技術(shù)路線1.3.2起草內(nèi)容建立天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法。飼料原料在進行分析檢測前，根據(jù)“GB/T19424—2018天然植物飼料原料通用要求”[11]中天然植物飼料原料具體種類及市場調(diào)研結(jié)果，目前市場上用于天然植物飼料原料的樣品主要分為三類，即單一型（粉碎物或粗提物）天然植物飼料原料、復配型（粉碎物或粗提物）天然植物飼料原料、混合型天然植物飼料原料。標準編制小組陸續(xù)從全國各地收集各類天然植物飼料原料，共計93種樣品，用于本標準的方法開發(fā)、方法驗證和實際樣品的測定。對初步建立的天然植物飼料原料中甘草酸前處理方法，以檢測含量為指標，分別考察不同提取溶劑、提取體積、提取時間對提取效率的影響。對天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜方法，分別從專屬性、線性、檢出限、定量限、精密度、準確度、耐用性、標準品穩(wěn)定性等方面進行方法學驗證。本標準的主體內(nèi)容包括，范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、原理、試劑或材料、儀器設備、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理、精密度等。本標準適用于天然植物原料中甘草酸含量的測定。1.4起草單位本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)大學、全國畜牧總站、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心、青島農(nóng)業(yè)大學。1.5主要起草人本文件主要起草人：郝智慧、高雪嫣、李燕松、戰(zhàn)余銘、單麗燕、劉暢、唐啟和。2行業(yè)標準編制原則、行業(yè)標準主要內(nèi)容及其確定依據(jù)2.1標準編制原則在編制過程中，標準編制小組查閱了國內(nèi)外相關(guān)文獻、標準等資料，并對全國天然植物飼料原料及甘草作為飼料原料添加使用的市場規(guī)模進行了調(diào)研，參考各部門制定的同類標準方法及飼料生產(chǎn)企業(yè)相關(guān)的產(chǎn)品質(zhì)控方法，遵循“先進性、實用性、統(tǒng)一性和規(guī)范性”的原則，堅持標準的可操作性，完成了天然植物飼料原料中甘草酸的測定工作，形成了標準草案和編制說明。本標準編寫主要依據(jù)GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》[12]、GB/T20001.4—2015《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準》[13]、GB/T27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[14]以及GB/T19424—2018《天然植物飼料原料通用要求》[11]的要求進行起草制定，并且按照GB/T27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》[15]對方法學進行了考察，確保方法的科學性、可行性和可靠性。依據(jù)高效液相色譜法檢測天然植物飼料原料中甘草酸的優(yōu)化試驗、方法驗證試驗的數(shù)據(jù)及研究結(jié)果編制。利用高效液相色譜法，能夠快速、準確的檢測天然植物飼料原料中甘草酸的含量，通過檢測方法優(yōu)化和方法驗證，本方法靈敏度高，能夠滿足檢測天然植物飼料原料中甘草酸含量檢測的要求。標準制定符合我國國情，滿足相關(guān)檢測要求，且普適性強，操作簡單，易于推廣。2.2新舊標準對比問題迄今，我國尚無“天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法”國家標準、行業(yè)標準或地方標準。本文件系首次制定，不存在新舊標準水平對比的問題。2.3制定本文件的主要內(nèi)容及其確定依據(jù)對甘草酸含量檢測相關(guān)標準進行了查閱，目前已發(fā)表的國家及行業(yè)標準涉及的檢測范圍有限，如：GB/T22248—2008保健食品中甘草酸的測定[8]、SN/T3854—2014出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測定高效液相色譜法[9]，尚未制定天然植物飼料原料中甘草酸的標準測定方法。通過查找甘草酸含量檢測相關(guān)文獻，不論是檢測含甘草酸的藥品、藥材還是提取物，針對甘草酸的分離和檢測絕大部分采用了高效液相色譜法（見表2）。并且高效液相色譜法是一種具有簡單、快速、靈敏度高等特點的檢測方法，能夠?qū)μ烊恢参镲暳显现械挠行С煞诌M行測定。因此，通過選擇利用高效液相色譜法，建立一種高效、靈敏、便捷的甘草酸檢測方法，作為指導一線檢測重要活性成分指標甘草酸的方法，可為天然植物飼料原料的質(zhì)量檢測和監(jiān)測提供指導。表SEQ表\*ARABIC2以“甘草酸”為含量檢測指標的含量檢測方法部分相關(guān)文獻文獻名檢測手段參考文獻HPLC測定甘草提取物中甘草酸的含量HPLC[16]HPLC測定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量HPLC[17]HPLC法測定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量HPLC[18]HPLC法測定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量HPLC[19]甘草酸鉍散的質(zhì)量標準研究HPLC[20]高效液相色譜法測定清肺顆粒中甘草酸的含量HPLC[21]經(jīng)典名方溫經(jīng)湯標準湯劑HPLC指紋圖譜建立及9種成分含量測定HPLC[22]利尿合劑的質(zhì)量標準分析HPLC[23]UPLC-MS/MS法同時檢測參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量UPLC-MS/MS[24]根據(jù)GB/T19424—2018天然植物飼料原料通用要求，天然植物飼料原料（單一型和復配型）包含了不同的干燥物、粉碎物、粗提物、復配型和混合型產(chǎn)品形式。隨后，通過市場調(diào)研確定目前市場中存在的天然植物飼料原料的產(chǎn)品形式，最常見的天然植物飼料原料為粉碎物、粗提物、復配型粉碎物和粗提物、混合型產(chǎn)品（表3）。因此，在收集不同類型的樣品（單一型粉碎物、單一型粗提物、復配型粉碎物、復配型粗提物和混合型產(chǎn)品等），共計93種進行實驗（表4）。表SEQ表\*ARABIC3含甘草的可飼用天然植物原料產(chǎn)品的調(diào)研情況（單位：個）調(diào)查產(chǎn)品粉劑液態(tài)粗提物復配型注明規(guī)格未注明規(guī)格明確有效成分未明確有效成分30220815312510表SEQ表\*ARABIC4全部實驗樣品明細樣品類型樣品成分來源地單一型粗提物甘草粗提物煙臺單一型粗提物甘草粗提物保定冀中單一型粗提物甘草粗提物（GT7）濰坊單一型粗提物甘草粗提物濱州單一型粗提物甘草粗提物無錫單一型粗提物甘草粗提物保定安國單一型粗提物甘草粗提物保定冀中單一型粗提物甘草粗提物（GT8）北京單一型粗提物甘草粗提物（GT9）新疆單一型粗提物甘草粗提物（GT10）煙臺單一型粉碎物甘草粉碎物煙臺單一型粉碎物甘草粉碎物保定冀中單一型粉碎物甘草粉碎物濰坊單一型粉碎物甘草粉碎物濱州單一型粉碎物甘草粉碎物無錫單一型粉碎物甘草粉碎物（GF8）保定安國單一型粉碎物甘草粉碎物保定冀中單一型粉碎物甘草粉碎物菏澤單一型粉碎物甘草粉碎物（GF9）甘肅單一型粉碎物甘草粉碎物（GF10）內(nèi)蒙古復配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物保定冀中復配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物保定冀中復配型粗提物甘草粗提物+訶子粗提物無錫復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物保定冀中復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物無錫復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物濱州復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物保定冀中復配型粗提物甘草粗提物+女貞子粗提物濰坊復配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物保定冀中復配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物保定冀中復配型粗提物甘草粗提物+山茶籽粕粗提物濱州復配型粗提物甘草粗提物+山楂粗提物（4：6）保定安國復配型粗提物甘草粗提物+藤茶黃酮-c黃晶無錫復配型粗提物甘草粗提物+甜葉菊粗提物無錫復配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物保定冀中復配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物保定冀中復配型粉碎物甘草粉碎物+當歸粉碎物（1：1）（FP1）保定安國復配型粉碎物甘草粉碎物+黨參粉碎物煙臺復配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物保定冀中復配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物無錫復配型粉碎物甘草粉碎物+茯苓粉碎物煙臺復配型粉碎物甘草粉碎物+訶子粉碎物無錫復配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（6：4）菏澤復配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（9：1）菏澤復配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物煙臺復配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物保定冀中復配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物無錫復配型粉碎物甘草粉碎物+金銀花粉碎物無錫復配型粉碎物甘草粉碎物+女貞子粉碎物濰坊復配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物保定冀中復配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物煙臺復配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物保定冀中復配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物保定冀中復配型粉碎物甘草粉碎物+甜葉菊粉碎物無錫復配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物無錫復配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物煙臺復配型粉碎物甘草粉碎物+淫羊藿粉碎物保定冀中復配型粉碎物甘草粉碎物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺混合型甘草粗提物+川芎粉碎物（4：1）保定安國混合型甘草粗提物+黨參粉碎物煙臺混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物無錫混合型甘草粗提物+茯苓粉碎物煙臺混合型甘草粗提物+訶子粉碎物無錫混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物煙臺混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物無錫混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物無錫混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物濱州混合型甘草粗提物+女貞子粉碎物濰坊混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物煙臺混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+甜葉菊粉碎物無錫混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物無錫混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物煙臺混合型甘草粗提物+淫羊藿粉碎物保定冀中混合型甘草粗提物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺混合型甘草粉碎物+杜仲葉粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+甘草粗提物濰坊混合型甘草粉碎物+甘草粗提物濱州混合型甘草粉碎物+甘草粗提物保定安國混合型甘草粉碎物+甘草粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+訶子粗提物無錫混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物濱州混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物無錫混合型甘草粉碎物+蒲公英粗提物保定冀中混合型甘草粉碎物+山楂粗提物（1：4）保定安國混合型甘草粉碎物+藤茶黃酮-c黃晶無錫混合型甘草粉碎物+甜葉菊粗提物無錫混合型甘草粉碎物+淫羊藿粗提物保定冀中3主要試驗或驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟論證，預期的經(jīng)濟效果3.1主要試驗或驗證的分析、綜述報告3.1.1主要試劑與儀器a）主要試劑：水：GB/T6682，一級水。甲醇：色譜純。0.2mol/L乙酸銨溶液：稱取乙酸銨15.73g，用水溶解并稀釋至1000mL，混勻。乙酸銨緩沖溶液：準確量取冰醋酸5mL，0.2mol/L乙酸銨溶液165mL，混勻。流動相：準確量取甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻。甘草酸銨標準儲備液（1.0mg/mL）：準確稱取10mg甘草酸銨標準品（CAS：53956-04-0，純度≥96.2%）（精確至0.01mg）于10mL容量瓶中，用流動相溶解、定容，搖勻。2℃～8℃保存，有效期90d。甘草酸銨標準系列溶液：準確移取適量甘草酸銨標準儲備溶液，用流動相稀釋定容，配制成濃度為0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL的標準系列溶液。臨用現(xiàn)配。微孔濾膜：0.45μm，有機系。b）主要儀器：高效液相色譜儀：配紫外檢測器或二極管陣列檢測器。分析天平：精度0.01mg和0.1mg。超聲波清洗儀：240W。3.1.2試驗設計a）色譜檢測條件選擇依據(jù)：通過甘草酸峰形、分離度、理論塔板數(shù)等指標考察了不同C18色譜柱條件下樣品中甘草酸的檢測情況，確定相對較優(yōu)液相檢測條件。通過查閱甘草酸含量檢測相關(guān)的文獻、藥典、標準及其他資料顯示（表5），甘草酸的分離一般使用C18色譜柱。表SEQ表\*ARABIC5甘草酸含量檢測文獻中使用的色譜柱文獻名色譜柱參考文獻HPLC測定甘草提取物中甘草酸的含量C18[16]HPLC測定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量KromasilC18[17]HPLC法測定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量C18[18]HPLC法測定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量ZORBAXExundC18[19]甘草酸鉍散的質(zhì)量標準研究C18[20]高效液相色譜法測定清肺顆粒中甘草酸的含量C18[21]經(jīng)典名方溫經(jīng)湯標準湯劑HPLC指紋圖譜建立及9種成分含量測定KromasilC18[22]利尿合劑的質(zhì)量標準分析AgilentZORBAXXDBC18[23]UPLC-MS/MS法同時檢測參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量AgilentEclipsePlusC18[24]因此，比較了AgilentZORBAXSBC18、AgilentEclipseXDBC18、WelchXtimateC18、AgilentEclipsePlusC18、ShimadzuInertSustainC18等六種不同的C18色譜柱對樣品中甘草酸的分離效果。結(jié)果顯示（表6），C18色譜柱對甘草酸色譜峰的分離度良好。最終選擇分離度較好的ShimadzuInertSustainC18色譜柱進行了后續(xù)的試驗。表SEQ表\*ARABIC6不同色譜柱檢測分離度比較色譜柱分離度AgilentZORBAXSBC182.61AgilentEclipseXDBC183.03WelchXtimateC181.66AgilentEclipsePlusC182.17ShimadzuInertSustainC182.26WatersSymmetryShieldRP182.01通過高效液相色譜儀全掃光譜確定甘草酸最大吸收波長為250nm（圖2），因此，確定250nm為本方法的檢測波長。隨后，通過甘草酸峰形、分離度等指標考察了不同流動相、不同柱溫條件下甘草酸的檢測情況。結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%磷酸水（70：30，v/v）為流動相對樣品進行甘草酸含量檢測時，分離度約為1.72，但未能完全將甘草酸色譜峰（保留時間12.715min）與雜質(zhì)峰完全分離（見圖3A），而以甲醇-0.2mol/L乙酸銨溶液-冰醋酸（67：33：1，v/v/v）（見圖3B）為流動相對樣品進行甘草酸含量檢測時，分離度約為1.78，因此，選擇甲醇-0.2mol/L乙酸銨溶液-冰醋酸（67：33：1，v/v/v）作為流動相，即甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻。隨后考察了不同柱溫對甘草酸檢測效果的影響，比較了20℃、25℃、30℃、35℃等四種柱溫，隨著柱溫的增加，甘草酸保留時間隨之減少，峰高隨著柱溫的增加而增加（圖4）。盡管峰高越高檢測峰形越好，但隨著柱溫的增加，甘草酸保留時間的降低也將導致甘草酸色譜峰與雜質(zhì)峰更加接近，因此選取30℃為測定甘草酸含量的柱溫。圖SEQ圖\*ARABIC2甘草酸銨標準溶液（0.1mg/mL）光譜圖圖SEQ圖\*ARABIC3甲醇-0.1%磷酸水（70：30，v/v）(A)和甲醇-0.2mol/L乙酸銨溶液-冰醋酸（67：33：1,v/v/v）(B)對甘草酸的分離效果圖SEQ圖\*ARABIC4不同柱溫與甘草酸保留時間、吸光度的關(guān)系綜上所述，最終確定最佳液相檢測條件：色譜柱為C18，柱長250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或性能相當者；流動相為甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻；等度洗脫；流速為1mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為250nm；進樣量為10μL。b）樣品前處理方法選擇依據(jù)根據(jù)檢測甘草酸相關(guān)文獻及相關(guān)標準中的含量檢測方法，甘草酸的提取方法主要為超聲提取（表7），并且超聲提取方法可達到有效提高提取分離率，縮短提取時間、節(jié)約成本、甚至提高產(chǎn)品的質(zhì)量，同時達到增加產(chǎn)量的效果，故將提取方式確定為超聲提取。表SEQ表\*ARABIC7甘草酸含量檢測文獻中甘草酸的提取方法文獻名提取方法參考文獻HPLC測定甘草提取物中甘草酸的含量超聲提取[16]HPLC測定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量超聲提取[17]HPLC法測定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量超聲提取[18]HPLC法測定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量超聲提取[19]甘草酸鉍散的質(zhì)量標準研究超聲提取[20]高效液相色譜法測定清肺顆粒中甘草酸的含量超聲提取[21]利尿合劑的質(zhì)量標準分析超聲提取[22]UPLC-MS/MS法同時檢測參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量超聲提取[23]通過甘草酸峰形、峰面積、分離度等指標考察了不同提取體積、不同提取液、不同提取時間條件下甘草酸的檢測情況。分別比較了25mL、50mL、100mL的提取體積對GF10和GT8中的甘草酸進行提取，結(jié)果顯示（表8），3種提取體積下，甘草粉碎物中甘草酸含量無顯著性差異（P＞0.05），甘草提取物中甘草酸含量相差不大，但50mL提取液得到的甘草酸含量相對較高。為保證方法能夠?qū)⒏什菟嵬耆崛。佑盟幍渲械臋z測體積50mL。表SEQ表\*ARABIC8不同提取體積得到的含量比較提取體積/mL甘草粉碎物GF10檢測含量/%甘草提取物GT8檢測含量/%252.037.13502.047.301002.047.22在檢索文獻的過程中發(fā)現(xiàn)，大部分方法采用流動相對甘草酸進行提?。ㄒ姳?），部分方法使用了純甲醇提取、堿性溶液提取法，因此，本方法分別比較了甲醇、流動相、1mol/L氨水的提取效果。如圖5所示，不同提取溶劑不會影響甘草酸色譜峰的分離效果。但不同提取溶劑提取得到的甘草酸的量不同，甲醇作為提取溶劑時，GF10樣品中甘草酸含量為1.27%，明顯低于流動相、氨水提取液（分別為2.04%和2.02%）。對于GT8樣品來說也顯示出了相似的含量差異（甲醇6.6%、流動相和氨水提取液約7.4%）。因此，選擇流動相作為提取液。表SEQ表\*ARABIC9甘草酸含量檢測文獻中甘草酸的提取溶劑文獻名提取溶劑參考文獻HPLC測定甘草提取物中甘草酸的含量流動相[16]HPLC測定川芎茶調(diào)散中甘草酸的含量流動相[17]HPLC法測定不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量甲醇[18]HPLC法測定內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地甘草中甘草酸的含量流動相[19]高效液相色譜法測定清肺顆粒中甘草酸的含量流動相[20]HPLC法測定甘草中甘草酸的含量1mol/L氨水[21]利尿合劑的質(zhì)量標準分析流動相[22]UPLC-MS/MS法同時檢測參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨的含量70%甲醇[23]圖SEQ圖\*ARABIC5不同提取液對GF10中甘草酸的檢測圖譜。甲醇（A）、流動相（B）、1mol/L氨水（C）隨后，考察了不同的提取時間對甘草酸含量的影響，分別以25min、30min、35min為提取時間對GF10樣品和GT8樣品中甘草酸進行提取，結(jié)果顯示（表10），25min、30min、35min時測得的樣品含量相似。與25min相比，提取時間為30min時GF10樣品含量略有升高，隨著提取時間延長（35min），GF10樣品中甘草酸含量沒有繼續(xù)升高，說明30min即可將樣品中的甘草酸提取完全。因此，延用藥典方法，選擇超聲30min為提取時間，故選擇超聲時間為30min。表SEQ表\*ARABIC10不同提取時間GF10、GT8樣品中甘草酸含量比較提取時間/min甘草粉碎物GF10檢測含量/%甘草提取物GT8檢測含量/%251.987.28302.067.29352.047.29進一步，確定本方法最適稱樣量，依據(jù)《中國藥典》2000年版和《中國獸藥典》2000年版中甘草酸含量測定方法的取樣量0.3g，比較了三種不同的稱樣量（0.1g、0.3g和0.5g）的重復性。結(jié)果顯示（表11），不同類型樣品在使用不同稱樣量時，均能滿足重復性RSD不超過2%的要求，其中，0.3g和0.5g的稱樣量得到的重復性RSD更低，結(jié)果更可靠。為避免浪費試劑、產(chǎn)生過高的成本，選擇0.3g為本方法的取樣量。表SEQ表\*ARABIC11不同稱樣量對不同類型樣品檢測結(jié)果的重復性比較稱樣量甘草粉碎物（GF8）甘草粗提物（GT7）復配型粉碎物（FP1）平均值（g/kg）RSD/%平均值（g/kg）RSD/%平均值（g/kg）RSD/%0.1g31.711.4857.180.5714.541.240.3g31.700.5857.740.2113.950.450.5g30.720.7457.350.5013.920.52綜上所述，最終確定了如下的樣品前處理方法：稱取試樣0.3g，分別置于50mL容量瓶中，加入約45mL流動相，超聲30min，取出，放至室溫，用流動相定容至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜將樣液濾入樣品瓶中，供高效液相色譜儀測定。3.1.3方法學a）系統(tǒng)適應性按照“3.1”項下的色譜檢測條件及樣品前處理方法，經(jīng)測定天然植物飼料原料中甘草酸的出峰位置均無雜峰干擾（圖6）。圖SEQ圖\*ARABIC60.12mg/mL標準溶液(A)、單一型樣品(B)、復配型粉碎物樣品(C)、復配型粗提物樣品(D)、混合型樣品(E)檢測譜圖b）線性范圍甘草酸在0.01～0.20mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好（圖7），R2＞0.9999。圖SEQ圖\*ARABIC7甘草酸標準曲線c）檢出限和定量限將甘草酸銨標準品、單一型樣品、復配型樣品、混合型樣品進樣濃度為0.001mg/mL時，信噪比約為10，計算得到該方法的定量限為0.16g/kg（圖8）。將甘草酸銨標準品、單一型樣品、復配型樣品、混合型樣品進樣濃度為0.0004mg/mL時，信噪比約為3，計算得到該方法的檢出限為0.06g/kg。圖SEQ圖\*ARABIC80.001mg/mL標準溶液(A)、單一型樣品(B)、復配型粉碎物樣品(C)、復配型粗提物樣品(D)、混合型樣品(E)中定量限檢測譜圖d）精密度和加標回收率連續(xù)三天對GF9、GF10、GT8、GT9、GT10進行提取和檢測，每批平行3個樣品，計算批內(nèi)和批間精密度。采用三種加標水平，每種水平平行3個樣品的方法（3×3）進行加標回收率實驗。三個加標水平分別為80%、100%、120%，方法檢測量為6mg，故甘草酸的加標量分別為1.8mg、3.0mg、4.2mg，儲備液濃度為1mg/mL，故分別量取標準品儲備液1.8mL、3.0mL和4.2mL，并分別置于3個50mL容量瓶中，加入50%稱樣質(zhì)量的飼料原料，加入流動相至容量瓶內(nèi)體積約為45mL，超聲30min，放冷，用流動相定容至刻度，每種添加濃度水平平行制備3份，即得加標回收率考察溶液。本方法批內(nèi)精密度在0.15%～1.35%之間，批間精密度0.12%～1.23%（見表10）；甘草酸在1.8mg、3.0mg、4.2mg添加水平的加標回收率在92%～105%之間。天然植物飼料原料中甘草酸含量檢測的精密度和加標回收率見表12～表17。表SEQ表\*ARABIC12甘草酸批內(nèi)及批間精密度樣品批內(nèi)精密度/%批間精密度/%1批2批3批GF90.310.790.290.75GF100.850.521.351.23GT81.341.250.370.37GT90.150.590.870.12GT100.961.070.880.31表SEQ表\*ARABIC13GF9中甘草酸的加標回收率添加質(zhì)量/mg稱量粉碎物質(zhì)量/g實際檢測總質(zhì)量/mg實際檢測加標準品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.114236.5963.95594.1394.461.380.111266.6014.02995.890.115376.5893.92593.343.00.111355.3352.76491.9995.583.280.113415.5572.93997.790.113265.5282.91196.961.80.127344.6321.69093.6994.051.250.114254.3591.71895.360.118284.4111.67893.10表SEQ表\*ARABIC14GF10中甘草酸的加標回收率添加質(zhì)量/mg稱量粉碎物質(zhì)量/g實際檢測總質(zhì)量/mg實際檢測加標準品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.164327.2513.91693.2293.631.240.155297.1403.98894.940.165337.2513.89692.743.00.138215.6702.86495.4794.331.050.163266.1312.81793.890.164246.1432.80893.631.80.145264.6331.66091.9593.922.060.152314.8151.69994.010.144284.6821.73095.82表SEQ表\*ARABIC15GT8中甘草酸的加標回收率添加質(zhì)量/mg稱量粗提物質(zhì)量/g實際檢測總質(zhì)量/mg實際檢測加標準品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.039326.9914.00194.9897.045.010.040227.0003.93393.550.051448.2374.403102.603.00.045266.2712.82193.8494.181.180.032255.2612.80793.280.031435.2632.88695.421.80.046015.2441.71695.2996.671.850.036284.5591.79898.690.046165.2691.74196.02表SEQ表\*ARABIC16GT9中甘草酸的加標回收率添加質(zhì)量/mg稱量粗提物質(zhì)量/g實際檢測總質(zhì)量/mg實際檢測加標準品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.046217.1893.91292.9192.720.740.046267.2083.93193.280.047317.2273.87991.963.00.034245.2462.82493.7093.931.910.033405.2502.90095.830.037075.4042.76992.261.80.038164.4171.71094.6297.104.310.035064.1991.70694.760.036434.4261.861101.93表SEQ表\*ARABIC17GT10中甘草酸的加標回收率添加質(zhì)量/mg稱量粗提物質(zhì)量/g實際檢測總質(zhì)量/mg實際檢測加標準品總質(zhì)量/mg回收率/%平均值/%RSD/%4.20.049227.3223.86791.8792.650.830.043336.9423.91092.690.048267.3193.93593.413.00.049246.2712.81793.5593.090.430.041195.6832.79292.820.050306.3262.80192.901.80.038334.3761.69793.2693.241.340.028113.6341.66091.980.037234.3201.71294.48e）方法耐用性考察柱溫和流動相比例改變對甘草酸在不同檢測出樣品中分離度的影響，進而考察方法的耐用性，其分離度大于1.5，耐用性良好（表18）。表SEQ表\*ARABIC18方法耐用性（分離度）樣品種類柱溫流動相（甲醇-0.2mol/L乙酸銨-冰醋酸）比例35℃30℃25℃（70：30：1）（67：33：1）（65：35：1）GF92.592.642.612.292.642.78GF101.841.782.151.681.782.07GT82.562.622.572.332.622.76GT92.542.552.532.322.552.76GT102.562.572.562.332.572.77f）標準工作溶液的穩(wěn)定性結(jié)果表明，24h內(nèi)甘草酸銨標準工作液的穩(wěn)定性良好（見表19）。表SEQ表\*ARABIC1924h甘草酸銨標準工作液穩(wěn)定性樣品編號進樣時間/h保留時間/min峰面積平均值/%RSD/%108.9601727.11730.720.77228.9681743.2348.9831746.2488.9611710.75128.9921722.96249.0031734.2g）甘草酸銨標準儲備液的穩(wěn)定性為檢測儲備液穩(wěn)定性，連續(xù)三個月，每月同一時間進行一次含量檢測，每次均重新稱量甘草酸銨標準品，與儲備液穩(wěn)定性樣品進行比較，無顯著差異，表明儲備液三個月內(nèi)穩(wěn)定性良好（見表20）。表SEQ表\*ARABIC20甘草酸銨標準儲備液的穩(wěn)定性存放條件儲備液峰面積（n=3）RSD/%4℃存放臨用現(xiàn)配檢測時間第0個月———8863.388855.858853.620.06第1個月8769.258783.418795.308775.578759.018769.700.14第2個月9019.768989.098979.789014.758974.118992.230.21第3個月8836.308848.698860.758857.108862.048846.880.11h）甘草苷和甘草次酸的干擾檢測配置含甘草酸銨、甘草苷、甘草次酸均為0.2mg/mL的混標溶液。檢測圖譜顯示（圖8），甘草酸的保留時間為4.697min、甘草苷的保留時間為1.974min、甘草次酸的保留時間為44.052min。結(jié)果表明，甘草酸、甘草苷和甘草次酸保留時間相差較大，且峰分離度良好，甘草苷和甘草次酸對于甘草酸的檢測不存在干擾。圖8混標溶液（甘草酸、甘草苷、甘草次酸濃度均為0.2mg/mL）3.1.3方法驗證結(jié)果本標準方法經(jīng)國家飼料質(zhì)量檢驗檢測中心（北京）、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心、北京英太格瑞檢測技術(shù)有限公司等3家實驗室參加了該農(nóng)業(yè)行業(yè)標準的驗證，標準編制單位向驗證單位提供方法草案、驗證方案和標準品。驗證單位按照方法草案準備實驗用品，在規(guī)定時間內(nèi)完成了對標準方法的線性范圍、回收率和精密度等技術(shù)指標的驗證試驗并返回試驗結(jié)果。3家實驗室的驗證結(jié)果標明，方法的線性范圍、回收率和精密度等技術(shù)指標均符合GB/T27417—2017和GB/T27404—2008的要求，說明該方法可行。3.1.4實際樣品的測定使用本方法對從全國各地采集不同來源不同批次的單一型、復配型和混合型天然植物飼料原料，共93種。按照“3.1”項下的色譜檢測條件及樣品前處理方法，對這些樣品中的甘草酸進行了測定，結(jié)果如表21所示，不同類型樣品間含量差異較大，在93種樣品中甘草酸含量在0.77～88.08g/kg之間，同一類型樣品間甘草酸的含量也存在較大差異，其中，單一型粗提物中甘草酸的含量在44.65～88.08g/kg之間、單一型粉碎物中甘草酸的含量在12.01～30.70g/kg之間、復配型粗提物中甘草酸的含量在2.57～44.07g/kg之間、復配型粉碎物中甘草酸的含量在4.85～15.71g/kg之間、混合型天然植物飼料原料中甘草酸的含量在0.77～57.49g/kg之間。同時，實際樣品的測定結(jié)果顯示，不同類型的天然植物飼料原料（單一型粗提物、單一型粉碎物、復配型粗提物、復配型粉碎物、混合型）的稱樣量為0.3g時，均能夠滿足試驗要求。表SEQ表\*ARABIC21實際樣品中甘草酸含量測定結(jié)果樣品類型樣品名稱來源地甘草酸含量（g/kg）單一型粗提物甘草粗提物1煙臺78.81單一型粗提物甘草粗提物2保定冀中85.63單一型粗提物甘草粗提物3濰坊57.74單一型粗提物甘草粗提物4濱州86.31單一型粗提物甘草粗提物5無錫88.08單一型粗提物甘草粗提物6保定安國44.65單一型粗提物甘草粗提物7保定冀中79.55單一型粗提物甘草粗提物8北京76.95單一型粗提物甘草粗提物9新疆71.29單一型粗提物甘草粗提物10煙臺70.52單一型粉碎物甘草粉碎物1煙臺23.49單一型粉碎物甘草粉碎物2保定冀中20.76單一型粉碎物甘草粉碎物3濰坊25.17單一型粉碎物甘草粉碎物4濱州19.53單一型粉碎物甘草粉碎物5無錫18.81單一型粉碎物甘草粉碎物6保定安國31.70單一型粉碎物甘草粉碎物7保定冀中21.16單一型粉碎物甘草粉碎物8菏澤12.01單一型粉碎物甘草粉碎物9甘肅23.02單一型粉碎物甘草粉碎物10內(nèi)蒙古20.44復配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物1保定冀中37.39復配型粗提物甘草粗提物+杜仲葉粗提物2保定冀中40.03復配型粗提物甘草粗提物+訶子粗提物無錫40.80復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物1保定冀中36.32復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物2無錫40.03復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物3濱州10.27復配型粗提物甘草粗提物+黃芪粗提物4保定冀中39.56復配型粗提物甘草粗提物+女貞子粗提物濰坊39.17復配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物1保定冀中19.66復配型粗提物甘草粗提物+蒲公英粗提物2保定冀中39.67復配型粗提物甘草粗提物+山茶籽粕粗提物濱州44.07復配型粗提物甘草粗提物+山楂粗提物（4：6）保定安國2.57復配型粗提物甘草粗提物+藤茶黃酮-c黃晶無錫35.93復配型粗提物甘草粗提物+甜葉菊粗提物無錫40.04復配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物1保定冀中30.32復配型粗提物甘草粗提物+淫羊藿粗提物2保定冀中39.52復配型粉碎物甘草粉碎物+當歸粉碎物（1：1）保定安國13.95復配型粉碎物甘草粉碎物+黨參粉碎物煙臺9.99復配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物1保定冀中9.94復配型粉碎物甘草粉碎物+杜仲葉粉碎物2無錫9.96復配型粉碎物甘草粉碎物+茯苓粉碎物煙臺9.92復配型粉碎物甘草粉碎物+訶子粉碎物無錫10.34復配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（6：4）菏澤4.85復配型粉碎物甘草粉碎物+黃柏粉碎物（9：1）菏澤9.10復配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物1煙臺9.98復配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物2保定冀中9.89復配型粉碎物甘草粉碎物+黃芪粉碎物3無錫9.88復配型粉碎物甘草粉碎物+金銀花粉碎物無錫10.12復配型粉碎物甘草粉碎物+女貞子粉碎物濰坊12.82復配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物1保定冀中9.90復配型粉碎物甘草粉碎物+蒲公英粉碎物2煙臺9.95復配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物1保定冀中9.74復配型粉碎物甘草粉碎物+生白術(shù)粉碎物2保定冀中15.71復配型粉碎物甘草粉碎物+甜葉菊粉碎物無錫9.78復配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物1無錫10.07復配型粉碎物甘草粉碎物+楊樹花粉碎物2煙臺9.63復配型粉碎物甘草粉碎物+淫羊藿粉碎物保定冀中9.92復配型粉碎物甘草粉碎物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺9.67混合型甘草粗提物+川芎粉碎物（4：1）保定安國28.23混合型甘草粗提物+黨參粉碎物煙臺39.36混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物1保定冀中38.83混合型甘草粗提物+杜仲葉粉碎物2無錫39.71混合型甘草粗提物+茯苓粉碎物煙臺33.82混合型甘草粗提物+訶子粉碎物無錫41.68混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物1煙臺39.27混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物2保定冀中38.32混合型甘草粗提物+黃芪粉碎物3無錫38.22混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物1無錫30.49混合型甘草粗提物+金銀花粉碎物2濱州46.09混合型甘草粗提物+女貞子粉碎物濰坊40.99混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物1保定冀中38.69混合型甘草粗提物+蒲公英粉碎物2煙臺39.04混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物1保定冀中38.41混合型甘草粗提物+生白術(shù)粉碎物2保定冀中39.63混合型甘草粗提物+甜葉菊粉碎物無錫37.67混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物1無錫32.36混合型甘草粗提物+楊樹花粉碎物2煙臺39.76混合型甘草粗提物+淫羊藿粉碎物保定冀中39.80混合型甘草粗提物+棗粉（50%棗+50%蒙脫石粉）煙臺39.33混合型甘草粉碎物+杜仲葉粗提物保定冀中9.87混合型甘草粉碎物+甘草粗提物1濰坊52.70混合型甘草粉碎物+甘草粗提物2濱州57.49混合型甘草粉碎物+甘草粗提物3保定安國32.63混合型甘草粉碎物+甘草粗提物4保定冀中36.84混合型甘草粉碎物+訶子粗提物無錫10.13混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物1保定冀中9.82混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物2濱州9.31混合型甘草粉碎物+黃芪粗提物2無錫10.18混合型甘草粉碎物+蒲公英粗提物保定冀中9.65混合型甘草粉碎物+山楂粗提物（1：4）保定安國0.77混合型甘草粉碎物+藤茶黃酮-c黃晶無錫11.75混合型甘草粉碎物+甜葉菊粗提物無錫9.91混合型甘草粉碎物+淫羊藿粗提物保定冀中10.03此外，對其他天然植物飼料原料進行測定，并與甘草飼料原料進行復配或混合得到天然植物飼料原料的空白樣品色譜圖、復配及混合樣品色譜圖，結(jié)果顯示（圖9），不同種類樣品雜質(zhì)峰對甘草酸色譜峰均無干擾，表明該方法可適用于不同種類的天然植物飼料原料，具有較好的普適性。圖90.12mg/mL標準溶液(A)、金銀花粉碎物(B)及其對應復配型粉碎物樣品(C)、甜葉菊粗提物(D)及其對應復配型粗提物樣品(E)、淫羊藿粗提物(F)及其對應混合型樣品(G)檢測譜圖3.1.5綜述報告本文件對天然植物飼料原料中甘草酸的色譜條件及樣品前處理進行了優(yōu)化，包括流動相、柱溫、提取液、提取時間等對檢測方法的影響等，并對建立的檢測方法進行方法學驗證。上述技術(shù)參數(shù)的確定主要依據(jù)是課題組進行現(xiàn)場實驗室技術(shù)測定試驗獲取的數(shù)據(jù)資料。分別考察色譜條件（不同流動相、柱溫、檢測波長）、前處理條件（不同提取方式、提取溶劑、提取體積、提取時間）對檢測方法的影響。最終選擇檢測方法為：流動相：甲醇335mL，乙酸銨緩沖溶液170mL，混勻；等度洗脫；柱溫：30℃；檢測波長：250nm；進樣量：10μL；流速：1.0mL/min。平行做兩份試驗。稱取試樣約0.3g（精確至0.1mg），置于50mL容量瓶中，加入約45mL流動相，超聲30min，期間振搖2～3次，取出后冷卻至室溫，用流動相定容，搖勻，靜置。上清液用微孔濾膜過濾，備用。標準曲線范圍設置：以設計樣品濃度（約0.12mg/mL）為標準曲線范圍的中間濃度，設置線性范圍為0.01～0.20mg/mL。定量限、檢出限設置：樣品的定量限為0.16g/kg，檢出限為0.06g/kg。3.2技術(shù)經(jīng)濟論證擬定各種可能的技術(shù)經(jīng)濟方案，建立多種技術(shù)方案。按規(guī)劃目標的要求建立若干個技術(shù)方案，包括多種建設方案和多種改造方案（新技術(shù)方案代替舊技術(shù)方案）。對各種方案進行初步加工，確定對比方案評價標準。設計包括數(shù)量、質(zhì)量、成本、投資、資金回收等各種指標。對技術(shù)方案進行分析、計算、比較。對各類指標進行“可比”處理，使各種技術(shù)方案在使用價值上等同化，然后進行比較。綜合分析、評價、擇優(yōu)。在分析、計算、比較的基礎上，對各種指標與指標體系進行定量與定性的分析評價，最后選出最優(yōu)的方案。3.3預期效益分析天然植物飼料原料中甘草酸的測定高效液相色譜法標準的制定預期產(chǎn)生如下作用和效益：通過本文件的制定，能夠為甘草酸在天然植物飼料原料中含量檢測提供科學依據(jù)。主管部門或有關(guān)企業(yè)可依據(jù)標準建立全面的檢測方法質(zhì)量管理體系，健全產(chǎn)品質(zhì)量管理法規(guī)，迅速提高和發(fā)展企業(yè)的