薄層掃描法09中藥一班薄層掃描法09中藥一班1薄層掃描法一、定義薄層掃描法(TLCS)又稱原位定量薄層色譜掃描法（QTLC）系指用一定的波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品定性定量的分析方法。薄層掃描法一、定義2回顧薄層色譜法（TLC)1、薄層板的制備（硅膠板,Al2O3板，聚酰胺薄膜等）2、點樣（選擇合適的展開劑，在薄板底1cm處畫基線，點樣）3、展開（浸入展開劑，展開到距薄板頂端1~2cm)4、檢視(在紫外光燈下觀察斑點）回顧薄層色譜法（TLC)1、薄層板的制備（硅膠板,Al2O33了解一下薄層掃描儀薄層掃描儀的組成及主要功能

薄層色譜掃描儀有多個廠家生產(chǎn)，型號不同，儀器外形、光路系統(tǒng)及某些功能也有差異，但其基本結(jié)構(gòu)及主要功能是基本相同的。每臺儀器都包括主機、數(shù)據(jù)處理及信號輸出等部分。

（1）分光器及測量范圍

大多數(shù)薄層掃描儀的分光器為光柵，少數(shù)為棱鏡，極個別的用濾光片，其測量范圍光柵為200-800nm，棱鏡為200-2500nm。

（2）光源及檢測器

光源室具有可見光源鎢燈，波長范圍為400-800，紫外光源氘燈波長范圍為200-400nm，熒光光源為氙燈或汞燈。操作時可通過光源選擇桿來變換光源選擇鏡的位置；檢測器一般為光電倍增管。

了解一下薄層掃描儀薄層掃描儀的組成及主要功能

薄層色4薄層掃描法ppt課件5表7-5-2國外幾種主要專用薄層色譜掃描儀表7-5-2國外幾種主要專用薄層色譜掃描儀6二、TLCS基本原理與方法薄層掃描法可分為薄層吸收掃描及薄層熒光掃描兩類方法。1.薄層吸收掃描法的基本原理薄層吸收掃描法是用可見光或紫外線的單色光照射展開后的薄層色譜板，測定薄層色譜斑點(簡稱斑點)的吸光度(A)隨展開壓離(L)的變化，而獲得A—L成A—Rf曲線，即薄層色譜掃描圖(簡稱掃描圖)。曲線上的色譜峰峰面積可用于定量分析。由于薄層板存在著明顯的散射現(xiàn)象，而使斑點中物質(zhì)的濃度與吸光度的關系不服從Beer定律，所以需田Kubelka—Munk(古柏爾卡—曼克)理論來描述。該方程式是薄層掃描法的定量分析基礎。定量校正方法可分為曲線校直法及非線性回歸法等。二、TLCS基本原理與方法薄層掃描法可分為薄層吸收掃描及薄層7設薄板固定相的厚度為X,入射光的強度為I.,當透過厚度x的的固定相后，照射在微分薄層厚度dx上的入射光強與反射光強分別為i和j時，如左圖。其入射光強的增量與反射光強的增量分別符合以下兩個微分方程：

設薄板固定相的厚度為X,入射光的強度為I.,當透過厚度x的的8即光照射到厚度為x的薄層后，光被吸收及散射。在入射方向，光強度因為被吸收與散射而減弱；在入射的反方向，則光強度因散射而增強。解上述方程得：

即光照射到厚度為x的薄層后，光被吸收及散射。在入射方向，光強9在薄層掃描時，人們只是對進入薄層和由薄層出來的光有興趣，也即上式的極端情況，x=0及x=X時在薄層掃描時，人們只是對進入薄層和由薄層出來的光有興趣，也即10薄層掃描法ppt課件11對比兩圖很易發(fā)現(xiàn)，由于薄層固定相的散射作用使在透射法中所測得的斑點的吸光度產(chǎn)生正偏差，而在反射法測定時產(chǎn)生負偏差。這是因為照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光強，增加了反射率，而降低了吸光度的緣故。其次，還可發(fā)現(xiàn)后圖比前圖的橫座標大25倍，這說明了反射法的靈敏度(響應值)比透過法小。1·1Kubelka-Munk曲線校直Kubelka－Munk曲線說明了薄層色譜斑點的吸光度與其濃度間呈非線性關系，該曲線是薄層掃描法進行定量分析的理論依據(jù)。曲線處理采用兩類方法：曲線校直法及計算機回歸法(線性及非線性回歸)。CS系列儀器采用前者，CAMAG儀器采用后者方法。曲線校直法是根據(jù)薄層板的散射參數(shù)SX值，將Kubelka－Munk曲線校正為直線，簡化A與KX間的關系，以利于定量分析。對比兩圖很易發(fā)現(xiàn)，由于薄層固定相的散射作用使在透射法中所測得12用曲線校正法校直Kubelka—Munk曲線，必須巳知薄層板的SX值，Mrck預制硅膠板的SX＝3，Merck預制氧化鋁板的SX＝7，Wako預制硅膠FM(硅膠GF254)板的SX＝7。國產(chǎn)預制薄層板及自制薄層板，可參考上述數(shù)據(jù)試調(diào)，而后檢查校正是否適宜，修正SX值再校，直至A—KX曲線成直線為止。檢查方法如下圖所示。圖中點樣量顯(橫坐標)常用單位為ug/點。

用曲線校正法校直Kubelka—Munk曲線，必須巳知薄層板13應用時應注意：

曲線校直法是一種簡便的薄層掃描定量校準方法，但比較粗糙，且有時難于準確知道薄層板的SX值。為了降低定量誤差，應使標準品的色譜峰峰面積與待測品(供試品)的色譜峰面積盡量接近為好。應用時應注意：142.薄層吸收掃描法的掃描方式及條件的選擇薄層吸收掃描法的掃描條件，包括掃描方式、波長及測光方式等。掃描方式分為直線式及鋸齒式掃描。掃描波長的選擇至關重要，不僅關系檢測靈敏度，而且關系干擾的排除等。測光方式分為透射式及反射式2.1掃描方式選擇(1)直線掃描直線式掃描是用一光帶先照射在薄層板的一端，而后作直線運動至另—端。在作直線式掃描時，實際上是光帶固定，薄層板相對于光帶作直線運動。2.薄層吸收掃描法的掃描方式及條件的選擇15在作直線掃描時，光帶的長度對掃描后所得的色諾峰峰面積影響很大，下圖說明了光帶越長，所得的色譜蜂面積越小，反之則峰面積越大。光帶太長，檢測靈敏度低，光帶太短，光帶只通過斑點的一部分，所得的蜂面積，不能真實反砍斑點的吸收情況。因此，正常掃描時，應使光帶長度略大于斑點直徑。在多斑點掃描的，光帶長度略大于最大斑點直徑。為了降低定量誤差，應使標準品斑點的直徑與檢品斑點的直徑盡量接近。樣品斑點為帶狀時，光帶長度應約為樣帶的2/3。

在作直線掃描時，光帶的長度對掃描后所得的色諾峰峰面積影響很大16不規(guī)則斑點，用直線式掃描定量，即使光帶長度適宜，定量誤差仍然較大，因為所得峰面積還與掃描方向有關。

綜上所述，直線式掃描較適用于規(guī)則圓形薄層色譜斑點及條狀薄層色譜斑點的定量分析。所能測定斑點的大小，以儀器的光帶長度為上限。例CS—930薄層掃描儀，出射狹縫最大長度(高度)為6mm，只能測定小于6mm的斑點。在作直線式掃描叫，光帶的步進距離ΔY也影響蜂面積。斑點小應選小步進距離，選擇適宜，能降低定量誤差。有關TLC及HPTLC板的光帶長度及步進距離的具體選擇見表。不規(guī)則斑點，用直線式掃描定量，即使光帶長度適宜，定量誤差仍然17(2)鋸齒式掃描

用截面積為正方形的光束照射薄層板，光束的運動軌跡為矩齒形。CS系列的擺動距閡最大為30mm，因此鋸齒式掃描適用于直徑小于30mm的斑點。

直線式掃在做鋸齒形掃描時，由于光束來回通過斑點，吸光度積分值比描大，重復性較好。鋸齒掃描還適用于不規(guī)則斑點的定量。雖然掃描方向不同時，所得的色譜峰形狀有差別，但積分值差別較小。機械鋸齒式描儀器掃描速度慢是其缺點，飛點掃描型儀器(如CS－9000型薄層掃描儀)則克服了此缺點。(2)鋸齒式掃描

用截面積為正方形的光束照射薄182.2波長選擇波長選擇適宜不僅可以提高靈教度，在雙波長法印還可排除干擾并可使基線平直，因而波長選擇關系重大。單波長與雙波長法的波長選擇分述如下。(1)單波長薄層掃描法用一種波長的單色光進行薄層掃描的方法稱為單波長薄層掃描法，簡稱單波長法。用單波長法所得的薄層色諾掃描圖是A－Rf或A－L曲線。通常選λmax為測量波長，以增加檢測靈敏度。單波長法較適用于分離度較好，無背景干擾的薄層色譜的掃描，否則基線波動較大(2)雙波長薄層掃描法用兩種波長的單色光交替照射薄層板，測定斑點對兩種波長的單色光的吸光度之差稱雙波長薄層掃描法，簡稱雙波長法。所得的薄層色譜掃描圖是ΔA－Rf或ΔA－L曲線。2.2波長選擇19(3)雙校長法的優(yōu)點

a.可以排除分離度不佳的兩個斑點間的相互干擾，能用于分離度不佳以至于完全重疊斑點的定量分析。

b.可以排除背景污染的干擾，使基線平直。

c.可以提高靈敏度。

d.可以改變色譜峰的倒正。

這些優(yōu)點的實現(xiàn)，主要取決于波長對的選擇。

(3)雙校長法的優(yōu)點

a.可以排除分離度不佳的203·定量分析方法TLCS最常用的定量方法是外標法，包括外標一點法和外標二點法。1外標一點法標準曲線通過原點（截距為零）時可用外標一點法定量。即只需一種濃度的對照品溶液，與供試液同板展開，分別測定其峰面積A,即C待=A標C標/A待2外標二點法該法是TLCS法中主要的定量分析方法。標準曲線不通過或一種濃度原點時只能用該法定量，至少需點兩種不同濃度兩種點樣量的對照品溶液，與供試液同板展開，分別測定其峰面積A，用對照品求直線方程：A=Km+B,代入即得。3·定量分析方法TLCS最常用的定量方法是外標法，包括外標一21例1山楂化滯丸中熊果酸的含量測定測定法：取重量差異項的本品3g，剪碎，精密稱定，加水10ml，放置使溶散，濾過，藥渣再用水10ml洗滌，在室溫干燥至松軟的粉末狀，在100℃烘干，連同濾紙一并至索氏提取器內(nèi)，加乙醚適量，加熱回流提取4h，提取液回收乙醚至干，殘渣用石油醚（30~60℃）浸泡2次，每次5ml（浸泡2min），傾去石油醚，殘渣加適量無水乙醇-三氯甲烷（3：2）混合溶液，微熱使溶解，定量轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶內(nèi)，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試液。另取熊果酸對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液。作為對照溶液，精密吸取供試液6ul及對照品溶液4ul與8ul，分別交叉點于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20:5:8:0.1）展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加熱5~7min，至斑點顯色清晰，取出，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定，進行薄層掃描，波長λs=535nm,λR=650nm,分別測量供試品與對照品A，計算即得.本品每丸含山楂以熊果酸（C30H48O3）計例1山楂化滯丸中熊果酸的含量測定測定法：取重量差異項的本22例1山楂化滯丸中熊果酸的含量測定1、+H2O10ml溶解，濾過+H2O10ml洗滌，干燥至松軟粉末狀100℃烘干索氏提取法+乙醚適量加熱回流4h殘渣石油醚（30~60℃）浸泡2次，5ml/次殘渣+適量無水乙醇-三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移定容至5ml供試液

2、另取熊果酸對照品適量，精稱+無水乙醇制成0.5mg/ml溶液對照品溶液3、精吸供試液6ul及對照品溶液4ul與8ul，分別交叉點于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20:5:8:0.1）展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加熱5~7min，至斑點顯色清晰，取出，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定，進行薄層掃描，波長波長λs=535nm,λR=650nm,分別測量供試品與對照品A，計算即得.本品每丸含山楂以熊果酸（C30H48O3）計取本品3g,剪碎，精稱例1山楂化滯丸中熊果酸的含量測定1、+H2O10ml溶解，23分析：本題采取雙波長掃描法,用外標二點法進行定量計算。得到△A與濃度C的線性關系代入即得。

熊果酸高含量為有光澤的棱柱狀(無水乙醇)或細毛樣針狀結(jié)晶(稀乙醇)，低含量為棕黃色或黃綠色粉末，具特殊的氣味，是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物。熔點283～288℃.比旋光度[α]D25+67.5°（C=1，1mol/L氫氧化鉀醇溶液中）。在15℃時，乙醇（99%）1毫升可溶解10毫克，沸騰1毫升可溶解45毫克。尚易溶于甲醇，丙酮，吡啶，不溶于水和石油醚

分析：本題采取雙波長掃描法,用外標二點法進行定量計算。得到△24例2香連丸中鹽酸小檗堿的含量測定測定法：取本品適量，研細，取約0.2g，精密稱定，置索氏提取器中，加鹽酸-甲醇（1：100）的混合液適量，加熱回流提取至提取液無色，將提取液移至100ml量瓶中，用少量上述混合液洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加上述混合液至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試液。另取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含20ug的溶液，作為對照品溶液。精密吸取供試液4ul、對照液2ul與6ul，分別交叉點于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-水（4：2：1：1：0.2）為展開劑，在另一槽中加等體積的濃氨試液，預飽和15min后，展開，展距約10cm，取出，晾干，進行熒光掃描，激發(fā)波長：λ=366nm，測供試品熒光強度與對照品熒光強度的積分值，計算即得。本品每1含黃連以鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計。例2香連丸中鹽酸小檗堿的