激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曹薇薇激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室原理2.在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用3.樣品要求激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用原理激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡基本配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Microscope熒光顯微鏡Anti-vibrationtable防震臺(tái)Confocalscananddetectorunit共聚焦掃描及檢測(cè)裝置ZEISS

LSM510METAConfocalSystem激光共聚焦掃描顯微鏡基本配置LaserComputerMic激光共聚焦掃描顯微鏡基本原理激光共聚焦掃描顯微鏡基本原理激光共聚焦掃描顯微鏡基本原理激光共聚焦掃描顯微鏡基本原理普通光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡的比較增加的部件掃描模塊電子控制器激光模塊激光掃描共聚焦顯微鏡普通廣視野光學(xué)顯微鏡圖像采集

并行，一次一幅

串行，逐個(gè)像素的照明區(qū)域廣視野

點(diǎn)照明光源鹵素?zé)艋蚬療?/p>

激光

檢測(cè)器

眼睛或CCD照相機(jī)

單通道光電倍增管多色多通道光電倍增管信號(hào)分離分色鏡，吸收濾光片

分色鏡組，吸收濾光片反射光柵（新）普通光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡的比較增加的部件激光掃描共聚焦顯非共聚焦/共聚焦圖像廣視野共聚焦非共聚焦/共聚焦圖像廣視野共聚焦非共聚焦/共聚焦圖像非共聚焦/共聚焦圖像激光共聚焦顯微鏡在同一時(shí)刻對(duì)樣品中的一點(diǎn)成像這一點(diǎn)的像在屏幕上顯示為一個(gè)像素為獲得樣品的二維圖像，激發(fā)光的聚焦點(diǎn)必須在樣品上移動(dòng)從點(diǎn)到二維圖像掃描鏡驅(qū)動(dòng)激發(fā)光束以線的方式移動(dòng)掃描過程中得到的像素構(gòu)成最終的二維圖像

聚焦光錐樣品X/Y圖像XY激光共聚焦顯微鏡在同一時(shí)刻對(duì)樣品中的一點(diǎn)成像從點(diǎn)到二維圖像掃通過激發(fā)光的水平移動(dòng)（X/Y），得到樣品中某一特定層面的二維圖像這一層面代表了樣品中的一個(gè)光學(xué)切片無物理接觸的采集要獲得樣品的三維信息，激發(fā)光聚焦點(diǎn)不僅要在XY方向上移動(dòng)，還要在Z方向上移動(dòng)通常，在掃描一個(gè)XY平面后，通過載物臺(tái)的垂直移動(dòng)使激發(fā)光聚焦點(diǎn)在Z方向上移動(dòng)結(jié)果是一個(gè)三維數(shù)據(jù)序列，包含著若干幅代表樣品中不同光學(xué)切片的XY圖像X/Y/Z序列Z軸驅(qū)動(dòng)從點(diǎn)到三維圖像通過激發(fā)光的水平移動(dòng)（X/Y），得到樣品中某一特定層面的二維普通廣視野熒光圖像樣品的厚度大于物鏡的焦深擴(kuò)展焦深共聚焦顯微鏡獲得的樣品的光學(xué)切片光學(xué)切片的厚度取決于共聚焦針孔的直徑普通廣視野熒光圖像擴(kuò)展焦深共聚焦顯微鏡獲得的樣品的光學(xué)切片一系列取自不同光學(xué)層面的的共聚焦圖像，包含著整個(gè)樣品的圖像信息擴(kuò)展焦深一系列取自不同光學(xué)層面的的共聚焦圖像，包含著整個(gè)樣品的圖像信時(shí)間序列時(shí)間序列記錄（真實(shí)時(shí)間）在線比率內(nèi)/外觸發(fā)（4內(nèi)4外）熒光漂白程序事件標(biāo)記像素時(shí)間感興趣區(qū)域/線的熒光強(qiáng)度平均值（在線或離線）最大時(shí)間分辨率：幅：5fpsby512x512或77fpsby512x32線（512像素）：~2600/sec.(0.38ms)速度級(jí)別：13X2

時(shí)間序列時(shí)間序列記錄（真實(shí)時(shí)間）MultifluorescenceimagingMultifluorescenceimagingapproachesareideallysuitedtodirectlyvisualizerelationshipsorinteractionsofmoleculesandothercellcomponentsintheirnaturalcontext.UsemultiplemarkerssimultaneouslyMultifluorescenceimagingMultiFITC/Rhodamine雙標(biāo)記：同時(shí)激發(fā)和檢測(cè)這兩種染料時(shí)，一部分FITC的發(fā)射光進(jìn)入了Rhodamine的檢測(cè)通道（發(fā)射串?dāng)_）多重?zé)晒獬上瘛?/p>

串?dāng)_問題bovineendothelialcells同時(shí)的掃描FITCRhodmergedFITC/Rhodamine多重?zé)晒獬上瘛當(dāng)_問題b分步的多重掃描FITCRhodmerged串?dāng)_問題的解決方法之一——

多重掃描（Multitracking）這個(gè)問題可以通過按順序分別激發(fā)和檢測(cè)兩種染料來解決先決條件是：用于激發(fā)FITC的激發(fā)光波長(zhǎng)對(duì)Rhodamine沒有激發(fā)（無激發(fā)串?dāng)_）分步的多重掃描FITCRhodmerged串?dāng)_問題的解決方法原理2.在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用3.樣品要求激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用原理激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用confocal在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

只要目的結(jié)構(gòu)是用熒光探針標(biāo)記的，都可用共聚焦激光掃描熒光顯微鏡觀察

活細(xì)胞動(dòng)態(tài)熒光測(cè)量：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca++、K+、H+等離子的動(dòng)態(tài)分布及動(dòng)態(tài)定量；

形態(tài)學(xué)研究：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡，以及寄生蟲和微生物表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)；中樞神經(jīng)系的F聯(lián)系、腫瘤細(xì)胞分類……

分子生物學(xué)：原位雜交、外源性基因在真核細(xì)胞的表達(dá)、定位，熒光能量共振轉(zhuǎn)移

大分子構(gòu)象的改變、熒光漂白恢復(fù)

細(xì)胞連接間的信息溝通，受體與配體相互作用……confocal在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用只要目的結(jié)原理:

檢測(cè)游離Ca2+變化的熒光探針多為Ca2+螯合劑，通常不能透過細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯(AM)相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后方能與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。1.活細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測(cè)量

熒光探針激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng)Kd

CalciumGreen-1507nm 530nm190nMCalciumGreen-2507nm 535nm550nMOregonGreen488494nm 520nm20,000nMFLuo3-AM,464nm 526nm390nMFurared 420/480nm

637nm140nM激光掃描共聚焦顯微鏡可對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)離子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、pH等）的動(dòng)態(tài)變化做實(shí)時(shí)定量分析；能進(jìn)行細(xì)胞生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。1.活細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測(cè)量Ca離子時(shí)間序列Ca離子時(shí)間序列Thenewcolocalizationdialog Scattergram,imagedisplayanddatatableareinteractivelylinkedScattergramDatatableImagedisplayTools2QuantitativeColocalizationAnalysisThenewcolocalizationdialogSIntensityBeforebleach

Afterbleach90minafterbleach3.熒光漂白恢復(fù)(FluorescenceRecoverafterphotobleaching;FRAP)

檢測(cè)細(xì)胞連接間的信息傳遞IntensityBeforebleach用GFP

標(biāo)記HeLa細(xì)胞的組蛋白(histone)。用FRAP來觀察組蛋白的擴(kuò)散速度（使用488nm激光）

FRAP用GFP標(biāo)記HeLa細(xì)胞的組蛋白(histone)。FRA4.熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)——大分子構(gòu)象的改變I.熒光能量共振轉(zhuǎn)移:

受激態(tài)熒光素將其能量向另一個(gè)熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的提供者叫供體熒光素，能量的接受者叫受體熒光素。供體熒光素受體熒光素1.供體與受體間的距離

<10nm或=1-7nm2.供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有實(shí)質(zhì)性的重疊II.熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件488nm520nm650nm540nm650nm488nm520nm供體熒光素(Cy2)受體熒光素(Cy3)供體熒光素(Cy2)受體熒光素(Cy3)4.熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FluorescenceResoFITC/TRITC,Cy3/Cy5,

CFP/YFPFluorescenceIntensityTime

檢測(cè)

以供體的激發(fā)波長(zhǎng)的光照射樣品,沒有共振轉(zhuǎn)移時(shí)，只檢測(cè)到供體的熒光，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時(shí)，供體的熒光減弱，受體被激發(fā)出現(xiàn)熒光。應(yīng)用

受體與配體的相互作用：亞基的結(jié)合與分離

大分子構(gòu)象的改變LigandCy3Cy5III.常用熒光共振轉(zhuǎn)移探針對(duì)FITC/TRITC,Cy3/Cy5,CFP/YFPCell-FITCHelaCellTubulin(FITC+TRITC)Cell-FITCHelaCellTubulin(FITHelaCellTubulin(FITC+TRITC)-Z-StackHelaCellTubulin(FITC+TRITC)-激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ppt課件激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ppt課件激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ppt課件激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ppt課件激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ppt課件激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ppt課件激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ppt課件HEKCells-3DVolvoxZ-StackHEKCells-3DVolvoxZ-Stack擬南芥細(xì)胞：葉綠體，線粒體Co-localization擬南芥細(xì)胞：葉綠體，線粒體Co-localizationFITC+SytoxGreenZebrafeshEmbryoUnknownFITC+SytoxGreenZebrafeshEmbr

激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用原理2.在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用3.樣品要求

激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用原理標(biāo)本：1.經(jīng)熒光探針標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)）2.固定的或活的組織3.固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在

Confocal專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上4.懸浮細(xì)胞，涂片或滴片后，用蓋玻片封片樣品制備要求標(biāo)本：樣品制備要求樣品制備要求載玻片、蓋玻片：

載玻片與蓋玻片的厚度應(yīng)盡可能薄，玻面光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。封裱劑：

常用緩沖甘油封固。需無自發(fā)熒光，無色透明。由于甘油的熒光亮度在pH為8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去，故常用甘油和0.5MpH為9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。樣品制備要求載玻片、蓋玻片：

載玻片與蓋玻片的厚度應(yīng)盡可能薄

熒光探針的選擇