關(guān)于生物制藥性質(zhì)：選修學(xué)時：32學(xué)分：2考核方式：閉卷參考教材：夏煥章、熊宗貴，生物技術(shù)制藥（第2版），高等教育出版社，2006；熊宗貴，生物技術(shù)制藥，高等教育出版社，19991.關(guān)于生物制藥性質(zhì)：選修1.前言當(dāng)今世界七大高新技術(shù)分別是：

現(xiàn)代生物技術(shù)航天技術(shù)信息技術(shù)激光技術(shù)自動化技術(shù)新能源技術(shù)新材料技術(shù)2.前言當(dāng)今世界七大高新技術(shù)分別是：2.

現(xiàn)代生物技術(shù)列在七大高新技術(shù)的首位。它在解決人類所面臨的諸如食物短缺、人類健康、環(huán)境污染和資源匱乏等重大問題上有著不可比擬的優(yōu)越性。3.現(xiàn)代生物技術(shù)列在七大高新技術(shù)的首位。3.就學(xué)科內(nèi)容來說：生物技術(shù)是以基因工程為主導(dǎo)；以發(fā)酵工程為基礎(chǔ)；包括細胞工程、酶工程、生化工程，隨著生物科學(xué)的發(fā)展，又衍生出第二代、第三代的蛋白質(zhì)工程、抗體工程、海洋生物技術(shù)等。4.就學(xué)科內(nèi)容來說：4.就產(chǎn)業(yè)來說：生物技術(shù)涉及制藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境保護、農(nóng)作物育種與病蟲害防治、能源開發(fā)等。5.就產(chǎn)業(yè)來說：5.第一章緒論6.第一章緒論6.本章主要內(nèi)容一、生物技術(shù)發(fā)展簡史二、生物制藥的概念和內(nèi)容三、新型生物藥物研制的理論和方法四、生物制藥技術(shù)新進展7.本章主要內(nèi)容一、生物技術(shù)發(fā)展簡史7.一、生物技術(shù)發(fā)展簡史生物技術(shù)是人類對生物資源（微生物、動植物）的利用、改造并為人類服務(wù)的技術(shù)，它的發(fā)展已有幾千年的歷史，將其發(fā)展過程按技術(shù)特征可分為三個階段。8.一、生物技術(shù)發(fā)展簡史生物技術(shù)是人類對生物資源（微生物、動植物1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段2、近代生物技術(shù)階段3、現(xiàn)代生物技術(shù)階段9.1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段9.1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段出現(xiàn)在公元前幾千年，直到20世紀(jì)30年代。主要是釀造技術(shù)，當(dāng)時人們只知道釀造技術(shù)，但不知道這些技術(shù)的內(nèi)在原因。1680年出現(xiàn)了顯微鏡。1857年用實驗方法證明了酒精發(fā)酵與酵母菌有關(guān)。1897年揭開發(fā)酵現(xiàn)象的奧秘。酶10.1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段出現(xiàn)在公元前幾千年，直到20世紀(jì)30年代至20世紀(jì)30年代該階段的產(chǎn)品：乳酸、酒精、丙酮、丁醇、檸檬酸、淀粉酶。該階段生產(chǎn)的特點：過程簡單，大多數(shù)屬于兼氣發(fā)酵或表面培養(yǎng)，生產(chǎn)設(shè)備要求不高，產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，屬于初級代謝產(chǎn)物。11.至20世紀(jì)30年代11.2、近代生物技術(shù)階段20世紀(jì)40年代。第二次世界大戰(zhàn)的爆發(fā)，急需療效好、毒副作用小的抗細菌感染藥物，出現(xiàn)了青霉素。產(chǎn)品價格昂貴，隨著發(fā)酵新技術(shù)的出現(xiàn)，又相繼發(fā)現(xiàn)了鏈霉素、紅霉素、金霉素等藥物。12.2、近代生物技術(shù)階段20世紀(jì)40年代。12.該階段的主要產(chǎn)品：醫(yī)藥：抗生素、維生素、甾體、氨基酸；食品工業(yè)：酶制劑、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工業(yè)：酒精、丙酮、丁醇、沼氣；農(nóng)林業(yè)：農(nóng)藥；環(huán)境保護業(yè)：生物治理污染。13.該階段的主要產(chǎn)品：13.（1）產(chǎn)品類型多，初級（氨基酸、酶、有機酸）；次級（抗生素）；生物轉(zhuǎn)化（甾體）。（2）生物技術(shù)要求高，純種、無菌、通氣、產(chǎn)品質(zhì)量要求也高。（3）生產(chǎn)設(shè)備規(guī)模大，常用500m3，最大2000m3。（4）技術(shù)發(fā)展速度快，如青霉素菌種，初期200單位/ml，目前8萬單位/ml形成了交叉學(xué)科——生化工程。該階段生物技術(shù)的特點14.（1）產(chǎn)品類型多，初級（氨基酸、酶、有機酸）；次級（抗生素）3、現(xiàn)代生物技術(shù)階段標(biāo)志，1953年美國Watson和英國的Crick共同提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，揭開了生命科學(xué)劃時代的一頁。此后，又相繼出現(xiàn)了一系列新發(fā)現(xiàn)和新進展，遺傳中心法則，破譯遺傳密碼，基因重組，單克隆抗體，DNA測序，動植物細胞培養(yǎng)技術(shù)。15.3、現(xiàn)代生物技術(shù)階段標(biāo)志，1953年美國Watson和英國的DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)16.DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)16.根據(jù)實驗研究表明，基因表達即遺傳信息的傳遞路線是：DNA→RNA（mRNA）→蛋白質(zhì)→生物性狀遺傳的中心法則17.根據(jù)實驗研究表明，基因表達即遺傳信息的傳遞路線是：遺傳的中心（1）基因操作技術(shù)日新月異；（2）新技術(shù)、新方法迅速商品化；（3）基因工程藥物和疫苗研究；（4）生物治療制劑產(chǎn)業(yè)化；（5）轉(zhuǎn)基因動植物取得重大突破；（6）現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)；（7）闡明生物體基因組及其編碼蛋白；（8）基因治療；（9）蛋白質(zhì)工程技術(shù)；（10）信息技術(shù)滲入生命科學(xué)——生物信息學(xué)。現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展趨勢18.（1）基因操作技術(shù)日新月異；現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展趨勢18.二、生物制藥的概念和內(nèi)容

生物技術(shù)制藥采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。生物技術(shù)藥物采用DNA重組技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)或其它生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。19.二、生物制藥的概念和內(nèi)容生物技術(shù)制藥19.化學(xué)藥物、生物藥物與中草藥是人類防病治療的三大藥源．生物技術(shù)藥物與天然生化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物制品統(tǒng)稱為生物藥物生物藥物四類：基因重組多肽、蛋白類治療劑；基因藥物；天然生物藥物；合成與部分合成的生物藥物。生物制藥技術(shù)：是一門講述生物藥物，尤其是生物工程相關(guān)藥物的研制原理、生產(chǎn)工藝及分離純化技術(shù)的應(yīng)用學(xué)科。20.化學(xué)藥物、生物藥物與中草藥是人類防病治療的三大藥源．20.生物制藥的發(fā)展歷史1796年，發(fā)明了用牛痘疫苗治療天花，從此用生物制品預(yù)防傳染病得以肯定。1860年，發(fā)現(xiàn)了細菌，開創(chuàng)了第一次藥學(xué)革命，為抗生素的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。1941年青霉素開發(fā)成功，標(biāo)志著抗生素時代的開創(chuàng)，推動了發(fā)酵工業(yè)的快速發(fā)展。50年代是抗生素發(fā)現(xiàn)的黃金時代，各種不同類型的抗生素被相繼發(fā)現(xiàn)；同期又發(fā)現(xiàn)了黑根霉可進一步轉(zhuǎn)化孕酮成11α-羥基孕酮，從而使考的松大量生產(chǎn)。在抗生素新藥的研制中開始采用HTS（Highthroughputscreening）技術(shù)。21.生物制藥的發(fā)展歷史1796年，發(fā)明了用牛痘疫苗治療天花，從此高通量藥物篩選一，概念

高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，以計算機對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，同一時間對數(shù)以千萬樣品檢測，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整體系運轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。

二.高通量篩選技術(shù)體系的組成

1.化合物樣品庫

化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個來源。其中,人工合成又可常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。

2.自動化的操作系統(tǒng)

自動化操作系統(tǒng)利用計算機通過操作軟件控制整個實驗過程。操作軟件采用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了的圖示代表機器的動作。自動化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設(shè)備以進行相應(yīng)的工作。

3.高靈敏度的檢測系統(tǒng)

檢測系統(tǒng)一般采用液閃計數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測計數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。

4.數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)

數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)承擔(dān)4個方面的功能:樣品庫的管理功能;生物活性信息的管理功能;對高通量藥物篩選的服務(wù)功能;藥物設(shè)計與藥物發(fā)現(xiàn)功能。

三.高通量篩選模型

常用的篩選模型都在分子水平和細胞水平，觀察的是藥物與分子靶點的相互作用，能夠直接認識藥物的基本作用機制。

1.分子水平的藥物篩選模型:受體篩選模型;酶篩選模型;離子通道篩選模型

1.1受體篩選模型:指受體與放射性配體結(jié)合模型。以受體為作用靶的篩選方法,包括檢測功能反應(yīng)、第二信使生成和標(biāo)記配體與受體相互作用等不同類型。

1.2酶篩選模型:觀察藥物對酶活性的影響。根據(jù)酶的特點,酶的反應(yīng)底物,產(chǎn)物都可以作為檢測指標(biāo),并由此確定反應(yīng)速度。典型的酶篩選包括1)適當(dāng)緩沖液中孵化;(2)控制反應(yīng)速度,如:溫度,緩沖液的pH值和酶的濃度等;(3)單時間點數(shù)器,需測量產(chǎn)物的增加和底物的減少。

1.3離子通道篩選模型:(1)貝類動物毒素的高通量篩選,其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結(jié)合位點，用放射性配體進行競爭性結(jié)合試驗考察受試樣品。(2)用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。

2.細胞水平藥物篩選模型

觀察被篩樣品對細胞的作用,但不能反映藥物作用的具體途徑和靶標(biāo),僅反映藥物對細胞生長等過程的綜合作用。包括:內(nèi)皮細胞激活;細胞凋亡;抗腫瘤活性;轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;細菌蛋白分泌;細菌生長。

高通量篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比有以下幾個優(yōu)點:反應(yīng)體積?。蛔詣踊混`敏快速檢測；高度特異性。但是，高通量篩選作為藥物篩選的敏快速檢測；高度特異性。但是，高通量篩選作為藥物篩選的方法,并不是一種萬能的手段，特別是在中藥研究方面，其局限性也是十分明顯的。首先，高通量篩選所采用的主要是分子、細胞水平的體外實驗?zāi)Ｐ停虼巳魏文Ｐ投疾豢赡艹浞址从乘幬锏娜嫠幚碜饔茫黄浯?，用于高通量篩選的模型是有限的和不斷發(fā)展的，要建立反映機體全部生理機能或藥物對整個機體作用的理想模型，也是不現(xiàn)實的。但我們應(yīng)該相信，隨著對高通量篩選研究的不斷深入，隨著對篩選模型的評價標(biāo)準(zhǔn)、新的藥物作用靶點的發(fā)現(xiàn)以及篩選模型的新穎性和實用性的統(tǒng)一，高通量篩選技術(shù)必將在未來的藥物研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

高通量篩選技術(shù)采用的先進檢測方法

光學(xué)測定技術(shù)。近年來，美、英兩國研究人員在高通量篩選檢測中，努力進行了光學(xué)測定方法的研究，建立了大量的非同位素標(biāo)記測定法，如用分光光度檢測法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑、組織纖溶酶原激活劑等，均獲得成功。

放射性檢測技術(shù)。美國學(xué)者GanieSM在高通量藥物篩選研究中，應(yīng)用放射性測定法，特別是親和閃爍（SPA）檢測方法，使在96孔板上進行的樣本量實驗得到發(fā)展。該方法靈敏度高，特異性強，促進了高通量藥物篩選的實現(xiàn)，但存在環(huán)境污染問題。

熒光檢測技術(shù)。美國學(xué)者GiulianokA研究認為，采用FLIPR（fluorometricimagingreadet）熒光檢測法，可在短時間內(nèi)同時測定熒光的強度和變化，對測定細胞內(nèi)鈣離子流及測定細胞內(nèi)pH和細胞內(nèi)鈉離子流等，是非常理想的一種高效檢測方法。

多功能微板檢測系統(tǒng)。由西安交通大學(xué)藥學(xué)院研制的1536孔板高通量多功能微板檢測系統(tǒng)，是目前國際上先進的高通量檢測系統(tǒng)，它可使篩選量進一步提高，現(xiàn)已在該院投入使用。

1．基本原理

高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數(shù)據(jù)，以計算機對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行分析處理。它的正常開展需要有一個高容量的化合物庫、自動化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測系統(tǒng)、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型。

1.1化合物樣品庫

高通量篩選是一種利用已有的化合物進行的體外隨機篩選。因此通過高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物(leadingcompounds)的有效性取決于化合物樣品庫中化合物的數(shù)量及其質(zhì)量?；衔飿悠返臄?shù)量是指不同樣品的數(shù)量?；衔飿悠返馁|(zhì)量主要由化合物結(jié)構(gòu)的多樣性決定的。許多活性反應(yīng)基團(reactivegroups)使初篩的假陽性大量增加，剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫的質(zhì)量。

化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個來源。

人工合成又可分為常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。采用常規(guī)化學(xué)合成的純化合物一直是國外制藥企業(yè)建立化合物樣品庫的主要來源。它們通過長年積累的化合物建立化合物樣品庫，通過購買和化合物交流使化合物樣品庫的數(shù)量和質(zhì)量大幅度提高。

組合化學(xué)(combinatorialchemistry)的出現(xiàn)為大量增加化合物的數(shù)量提供另外一種來源。組合化學(xué)的基本原理是采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，在特定的分子母核上加入不同的基團，在同樣條件下，產(chǎn)生大量的新化合物。這種方法在化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化方面已經(jīng)表現(xiàn)出強大的優(yōu)勢。但是，由于該方法是基于母核結(jié)構(gòu)的改造，因此產(chǎn)生的大量化合物在結(jié)構(gòu)多樣性方面尚有極大的不足。解決組合化學(xué)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的問題，已經(jīng)成為化學(xué)研究人員的研究課題。

從天然產(chǎn)物中分離出來的化合物，母核結(jié)構(gòu)和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現(xiàn)出來的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢。因此，增加樣品庫中具結(jié)構(gòu)多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫質(zhì)量的一個重要途徑?？鐕扑幤髽I(yè)為了增加高通量篩選的陽性率，已經(jīng)或正在尋求助買我國的天然產(chǎn)物單體。

1.2自動操作系統(tǒng)

高通量藥物篩選每天要對數(shù)千化臺物樣品進行檢測，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯。自動化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過條形碼加以標(biāo)記。自動化操作系統(tǒng)通過光電閱讀器對特定的微孔板上的特定位置進行操作，并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計算機內(nèi)，使篩選結(jié)果準(zhǔn)確，實驗過程快速。

自動化操作系統(tǒng)利用計算機通過操作軟件控制整個實驗過程。操作軟件采用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了的圖示代表機器的動作。編程過程簡潔明了，可操作性強。自動化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組成都分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設(shè)備以進行相應(yīng)的工作。

除了實驗步驟的需要以外，自動化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用于對照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移。96孔、384孔在酶活性檢測以及需同時開始、同時終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的。

自動化操作系統(tǒng)的一個重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應(yīng)板以及對它們進行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。

由此可見，高通量藥物篩選的自動化操作系統(tǒng)由計算機及其操作軟件、自動化加樣設(shè)備、溫孵離心等設(shè)備、堆棧4個部分組成。不同的單位可根據(jù)主要篩選模型類型、篩選規(guī)模選購不同的部分整合成為一個完整的操作系統(tǒng)。

1.3檢測系統(tǒng)

快速、高靈敏度的檢測技術(shù)是高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。在高通量藥物篩選中，檢測系統(tǒng)一般采用液閃計數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測計數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。檢測儀器靈敏度的不斷提高，即使對微量樣品的檢測，也可以得到很好的檢測效果。

1.3.1液閃計數(shù)放射性同位素廣泛用于受體結(jié)合測定、細胞毒性、細胞增殖實驗、藥物代謝示蹤以及基因分析中。由于采用了雙光電倍增管及時間分辨偶合回路(time-resolvedcoincidencecircuit)技術(shù)，有效地降低了背景信號的干擾，使測定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測中，背景信號可控制在10cpm左右。

親和閃爍分析(scintil1ationproximityassay，SPA)是一種新的液閃分析法。該方法在細胞表面受體藥物篩選中應(yīng)用較為普遍。在高通量篩選測定細胞表面受體親合結(jié)合作用時，放射配體標(biāo)記濾過分析技術(shù)由于需要進行分離，現(xiàn)已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術(shù)通過親合結(jié)合，將放射性配基結(jié)合到具有受體的閃爍球上，從而產(chǎn)生光子，減少了放射配體標(biāo)記分析中的游離配基與結(jié)合配基的分離過程，使得放射配基分析可完全以自動化的方式進行，適于進行高通量篩選。產(chǎn)生低能量放射粒子的同位素可被用來進行放射性標(biāo)記，而這種低能量放射粒子在短距離內(nèi)可被重吸收，以確保只有結(jié)合到受體表面的配基才被檢測到。SPA技術(shù)被廣泛的應(yīng)用到激酶、核酸處理酶分析以及受體配體的相互作用分析中。

1.3.2分光光度法為了適應(yīng)高通量藥物篩選，許多公司都生產(chǎn)了具備計算機接口并能對多孔板進行同時檢測的分光光度計。以MolecularDevice公司的spectra190為例，它采用8條光導(dǎo)纖維同時對8孔進行測定。測定波長以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進行選擇。對未知物質(zhì)，可在該范圍內(nèi)進行掃描以確定其特征吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測數(shù)據(jù)以不同文件格式輸出，可用隨機軟件或通用數(shù)據(jù)處理軟件進行處理。方便、快速、準(zhǔn)確、自動化程度高。分光光度法高靈敏儀器同自動化操作系統(tǒng)的連接，使得基于紫外、可見光譜的高通量藥物篩選模型成為主要模型種類。

1.3.3化學(xué)發(fā)光檢測化學(xué)發(fā)光指生色物質(zhì)在酶促作用下，化學(xué)能以光子的形式釋放出來。化學(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類分為輝光型和閃光型發(fā)光兩種。輝光型化學(xué)發(fā)光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎(chǔ)的發(fā)光反應(yīng)。其發(fā)光時間較長且穩(wěn)定。而以發(fā)光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發(fā)光反應(yīng)則是閃光型發(fā)光反應(yīng)，其發(fā)光時間較短。由于時間分辨及偶合回路技術(shù)的使用，對于背景的去除更為有效，使得化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度達到0.1pg數(shù)量級。在單孔多點噴射技術(shù)中，用于檢測化學(xué)發(fā)光的光導(dǎo)纖維末端帶有一噴頭，用來加入反應(yīng)性底物。反應(yīng)性底物從100個小孔噴出，使反應(yīng)性底物加入孔中后即可均勻混合。發(fā)光反應(yīng)同時啟動后，可立即進行測定，對于閃光性化學(xué)發(fā)光的測定更為有利。

1.3.4激發(fā)熒光檢測新型激發(fā)熒光檢測儀在傳統(tǒng)儀器的基礎(chǔ)上，用連續(xù)的激發(fā)光諧和測定光譜取代固定光譜，使模型的建立更具備靈活性。熒光檢測方法靈敏是因為多數(shù)熒光基團都有短暫的半衰期，即使用較弱的激發(fā)光源也能獲得大量的光子流。這種特性以及多種可采用的熒光模式，使得熒光檢測技術(shù)成為高通量篩選必不可少的應(yīng)用手段。熒光技術(shù)在均相篩選分析中廣為應(yīng)用。其中，包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，熒光偏振(FP)，時間分辨熒光(TRET)以及熒光相關(guān)譜(FCS)等技術(shù)。

1.4數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)

高通量藥物篩選的特點是對數(shù)以萬計的化合物樣品進行多模型的篩選。與高通量藥物篩選相適應(yīng)的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)主要承擔(dān)4個方面的功能。

樣品庫的管理功能：化合物樣品庫對進行高通量藥物篩選的化合物樣品的各種理化性質(zhì)進行存儲管理。對每一個新入庫的化合物進行新穎性分析，排除結(jié)構(gòu)雷同的化合物，避免不必要的篩選。由于高度反應(yīng)性基團增加了假陽性出現(xiàn)的機率，樣品庫對新入庫的化合物進行反應(yīng)基因檢測以去除這類化合物。

生物活性信息的管理功能：生物活性庫存貯每一化合物經(jīng)過不同模型檢測后的結(jié)果，并根據(jù)多個模型的檢測結(jié)果對化合物的生物活性進行綜合評價。

對高通量藥物篩選的服務(wù)功能：高通量藥物篩選的工作量大，自動化程度高，也涉及到許多繁瑣的工作。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)對與藥物篩選相關(guān)的業(yè)務(wù)往來通訊、檔案管理以及各種樣品標(biāo)簽的打印進行管理，使高通量藥物篩選的各個環(huán)節(jié)程序化、標(biāo)準(zhǔn)化。

藥物設(shè)計與藥物發(fā)現(xiàn)功能：高通量藥物篩選產(chǎn)生大量的化合物結(jié)構(gòu)信息，隨著篩選的進行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)通過對同一模型不同的呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)進行分析，找出其構(gòu)效關(guān)系，從而為藥物設(shè)計提供參考。

1.5篩選模型

是指用于檢測藥物作用的實驗方法。由于高通量篩選要求反應(yīng)總體積小，而且，反應(yīng)具有較高特異性和敏感性，因此對于篩選模型也要求較高，常用的篩選模型都在分子水平和細胞水平，觀察的是藥物與分子靶點的相互作用，能夠直接認識藥物的基本作用機制。目前這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細胞反應(yīng)方面。近年也出現(xiàn)了基因水平的藥物篩選模型，使藥物篩選模型的范圍更為廣泛。

1.5.1以酶為靶的高通量篩選以酶為作用靶的高通量篩選方法，絕大多數(shù)是直接檢測酶活性。具體方法根據(jù)酶的不同而不同，主要有基于放射性的方法和基于比色、熒光的方法兩大類。

基于放射性的方法多是將底物標(biāo)記，測定放射性產(chǎn)物的生成。Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制劑(抗真菌)的高通量篩選方法。將含有酶的菌絲提取物、α-淀粉酶和UDP-14Ｃ-葡萄糖加入96孔板的孔中，溫孵、反應(yīng)。終止反應(yīng)后，濾去未被合成進入的底物。閃爍計數(shù)檢測濾器上保留的(1,3)β-葡聚糖，指示酶活性大小。

也有將酶標(biāo)記，測定被特異結(jié)合的酶的方法。Vollmer等建立了一種以青霉素結(jié)合蛋白(PBP)為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉(zhuǎn)移酶又是肽轉(zhuǎn)移酶，該法是篩選其糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的活性位點上的可結(jié)合物。將莫諾霉素(moenomycin)結(jié)合于一種小球上，制成混懸液，加入96孔板，然后加入3Ｈ標(biāo)記的PBP(細菌膜粗提物)和受試化合物，孵育、過濾去掉非結(jié)合的放射性，閃爍計數(shù)測得的放射性指示PBP與莫諾霉素結(jié)合的情況及受試化合物對其影響。

另外，基于放射性而無需過濾分離的SPA也有應(yīng)用。Brown等建立了內(nèi)源性肽酶的水解活性檢測方法，用以研究其抑制劑。用3Ｈ標(biāo)記的肽底物，通過生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA閃爍球相連。酶解使3Ｈ隨肽的斷裂而離開閃爍球。測定3Ｈ放射性作用于閃爍球產(chǎn)生的閃爍信號的丟失量，即指示酶活性大小。

基于比色、熒光等的方法有一些報道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制劑的篩選方法。酸性條件下，脂的過氧化物能把Fe2+氧化為Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenolorange)，產(chǎn)物在可見光區(qū)620nm有強烈吸收。在96孔板上測定。Zhang等建立了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(抗病毒藥物)的高通量篩選方法。方法使用了“同質(zhì)時間分辨熒光”(homogenoustimeresolvedfluorence，HTRF)技術(shù)，既實現(xiàn)了非分離操作(同質(zhì))，又避免了放射性同位素的使用。該方法基于逆轉(zhuǎn)錄酶能很容易地將核苷酸類似物(如生物素-11-dUTP)引入新生DNA鏈。在96或384孔板上，將生物素化的引物/模板與抗生蛋白鏈菌素-銪在板孔中混合孵育，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物啟動反應(yīng)。反應(yīng)60min后，加入鏈親和素-別藻藍蛋白(streptavidin-allophycocyanin)，孵育，用HTRF分析儀讀取數(shù)據(jù)。該法也可用于多種其他的核酸聚合酶。

1.5.2以受體為靶的高通量篩選以受體為作用靶的高通量篩選方法，包括檢測功能反應(yīng)、第二信使生成和標(biāo)記配體與受體相互作用等不同類型。檢測功能反應(yīng)的優(yōu)點是易于區(qū)分激動劑和拮抗劑。經(jīng)典的功能檢測方法通量低，而引入基于重組技術(shù)的報告基因檢測方法極大地提高了篩選通量，既高效且節(jié)省成本。檢測第二信使或下游機制如磷酸化，傳統(tǒng)方法也比較麻煩，不適于高通量檢測，但將這些機制與報告基因相偶聯(lián)則能克服。

1.5.3以離子通道為靶的高通量篩選Negri等建立了貝類動物毒素的高通量篩選方法。其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)結(jié)合位點，用放射性配體(3H-STX)進行競爭性結(jié)合試驗考察受試樣品。Yong等用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。

1.5.4以核酸為靶的高通量篩選Hamasaki等建立了以16SrRNA編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和HIV-RRERNA結(jié)構(gòu)為靶的抑制劑的高通量篩選方法。尋找類似氨基糖甙類抗生素而親和力更高或作用于相同核酸的其他位點的新化合物，以及不易被代謝失活的新化合物。方法基于當(dāng)含芘的氨基甙類似物結(jié)合于RNA時，芘的熒光被淬滅的原理。在96孔板上，將芘碳酰巴龍霉素(PCP)，RNA結(jié)構(gòu)配成溶液后加入有受試化合物的板孔中，用熒光讀板器考察熒光恢復(fù)的程度。

1.5.5以細胞功能為基礎(chǔ)的高通量篩選

1.5.5.1內(nèi)皮細胞激活內(nèi)皮細胞激活是急慢性炎癥過程中重要的組成環(huán)節(jié)。Rice等以Ｅ選擇蛋白在細胞表面的表達作為標(biāo)志，建立了內(nèi)皮細胞激活抑制劑的高通量篩選方法。建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。IL-1刺激下，Ｅ選擇蛋白在內(nèi)皮細胞表面的表達用ELISA方法定量。方法包括細胞固定、加液、加受試化合物等操作，能保持細胞完整，不昂貴，可重復(fù)，篩選速度可達每星期1000種化合物。適用化合物范圍很寬，并且方法用細胞作為檢測對象，使能夠較早地發(fā)現(xiàn)細胞對化合物的攝取及化合物的細胞毒性。

1.5.5.2細胞凋亡Erusalimsky等建立了新型細胞凋亡調(diào)節(jié)物的高通量篩選方法。細胞預(yù)先用3Ｈ胸苷標(biāo)記，與凋亡誘導(dǎo)物孵育后，連續(xù)經(jīng)過兩種玻璃濾器。一個是中性的，捕獲完整的染色質(zhì)和高分子量ＤＮＡ。另一個裝有DEAE活性基團，捕獲低分子量DNA碎片。通過對濾器上放射性的測量，可以對DNA的破碎情況定量。

1.5.5.3抗腫瘤活性Lu等建立了用高通量“生物活性指紋”篩選抗肺癌藥物的方法，考察受試分子(類維生素Ａ及類維生素Ａ相關(guān)分子)對許多不同細胞系的效應(yīng)特點。檢測指標(biāo)包括：(1)肺癌細胞生長抑制檢測。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來源。細胞暴露于受試化合物5ｄ后，用標(biāo)準(zhǔn)比色法測定存活細胞百分率。20%生長抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制檢測，用以區(qū)分細胞生長抑制作用和細胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292非小細胞肺癌細胞，暴露于受試物一定時間。然后對細胞進行清洗，植于無受試物的培養(yǎng)介質(zhì)共7d。用結(jié)晶紫對細胞染色，考察集落形成情況。(3)凋亡檢測，用ELISA方法測量細胞DNA破碎。(4)轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測，用以考察受試化合物是否有類維生素Ａ受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用。方法是將HeLaTK-細胞用73Col-CAT報告基因連同受體的表達載體轉(zhuǎn)染，與受試物一起培養(yǎng)，用ELISA方法檢測CAT活性。

1.5.5.4G2檢查點(G2checkpoint)Roberge等建立了G2期檢查點抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7mp53細胞培養(yǎng)，種在96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上。照射使細胞進入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進入Ｍ期的細胞數(shù)量，即抑制G2檢查點程度。

1.5.5.5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構(gòu)建融合報告基因，轉(zhuǎn)染細胞，選擇蟲熒光素酶表達能被TGFβ高誘導(dǎo)的克隆。將細胞植于96孔板，與受試化合物孵育后，稀釋并加入Steady-Glo底物測蟲熒光素酶活力，與對照比較，計算相對酶活性增加值。

1.5.5.6細菌蛋白分泌Alksne等建立了以抑制細菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基于SecA-lacZ融合報告基因。SecA是一種自我調(diào)控翻譯的蛋白，當(dāng)細菌蛋白分泌被干擾時，該報告基因被誘導(dǎo)。

1.5.5.7細菌生長Chung等建立了抑制分枝桿菌生長化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結(jié)核分枝桿菌，因其具有生長迅速以及非感染性的特點。通過測定細胞攝入放射性標(biāo)記的尿嘧啶，考察受試化合物對分枝桿菌活力的作用。用96孔板的形式，1d內(nèi)可以測試數(shù)千個樣品。

2．生藥活性成分的高通量篩選

樣品是高通量藥物篩選的物質(zhì)基礎(chǔ)，樣品庫來源的化學(xué)多樣性是決定高通量篩選技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素之一。前面我們談到，化合物樣品主要有常規(guī)化學(xué)合成、組合化學(xué)合成和從天然產(chǎn)物中分離純化幾個來源。而從天然產(chǎn)物中分離出來的化合物，由于其母核結(jié)構(gòu)和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現(xiàn)出來的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢。

我國擁有非常豐富的藥材資源，幾十年來，我們應(yīng)用藥理學(xué)手段，對我國的傳統(tǒng)藥物進行了大規(guī)模的研究和篩選，取得了巨大成就。但是，僅僅依靠傳統(tǒng)的藥理實驗方法，既耗時，勞動強度又大，還需要使用大量實驗動物，顯然不能適應(yīng)大量樣品的同時篩選。雖然經(jīng)過努力，已從生藥中分離、提取、純化出大量化合物，但由于研究手段的落后，使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費。

因此，將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于生藥的活性成分研究，既是對高通量篩選技術(shù)的不斷完善，又是將這一技術(shù)應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化研究的有益嘗試。

如何對生藥的活性成分進行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區(qū)別主要在于篩選前需要從生藥中將化合物提取出來并進行適當(dāng)?shù)姆蛛x和化學(xué)多樣性的評價。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評價的問題。

2.1提取由于高通量篩選需要大量的樣品來源，所以常規(guī)的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個快速、高效、連續(xù)、自動化的提取方法顯得迫在眉睫。加速溶劑提取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一個新的提取技術(shù)，在準(zhǔn)備好樣品和對提取方法（或程序）進行設(shè)定后，自動進樣和自動收集裝置就可以連續(xù)對最多24個不同樣品自動完成樣品的提取和提取液的收集，簡單方便。應(yīng)用這一技術(shù)，可以得到大量的生藥的提取物。

2.2分離及化學(xué)多樣性評價我們都知道，生藥的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對生藥的提取物進行適當(dāng)?shù)姆蛛x。在眾多的分離手段中，制備型HPLC應(yīng)該是最為理想的，它具有快速、高效、自動化等諸多優(yōu)點。

分離完成后還需要對分離的物質(zhì)進行化學(xué)多樣性的評價，以提高高通量篩選的效率。以前，這種評價多是基于物種的地理分布、生物學(xué)分類、化學(xué)分類以及基源等關(guān)系，近年來，隨著科技的進步，多種現(xiàn)代化手段開始應(yīng)用于化學(xué)多樣性的評價。其中，色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI-MS）技術(shù)在這方面做出了有力的嘗試。首先，它做出成分的離子信號（m/z）對保留時間的平面圖，然后對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)的相似度評估從而對樣品的多樣性進行定量的評價。接著，三維的HPLC數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為CDF文件格式并傳輸?shù)経NIX工作站。數(shù)據(jù)文件中的每一個離子（包括保留時間、質(zhì)量、離子強度等數(shù)據(jù)）被定位在一個二維圖譜中，保留時間和質(zhì)量分占一個軸，離子強度數(shù)據(jù)儲存在位點中。濾除噪聲以后，離子的中心時間和中心質(zhì)量被計算出來。根據(jù)對LCMS的數(shù)據(jù)處理，混合物間的相似度被定量地計算出來。這種數(shù)據(jù)處理基于以下的一種關(guān)系，這種關(guān)系表征了樣品1中的離子i和樣品2中的離子j的“化學(xué)空間”距離。

其中，ti表示離子i的色譜保留時間，mi表示離子i的質(zhì)荷比（m/z），wt是保留時間的權(quán)重系數(shù)，wm是質(zhì)量的權(quán)重系數(shù)。dij是離子i和離子j的歐幾里的距離，n1和n2分別是樣品1和樣品2中確認的離子數(shù)。sij是離子i和離子j之間的相似度（0-1），相似度值為1表明是相同樣品，相反，相似度值接近0則表明樣品具有很高的化學(xué)多樣性。通過這種方法，可以很好的解決樣品化學(xué)多樣性的評價問題。

3．問題及展望

當(dāng)然，高通量篩選作為藥物篩選的一種方法，它并不是一種萬能的手段，特別是在中藥研究方面，其局限性也是十分明顯的。首先，高通量篩選所采用的主要是分子、細胞水平的體外實驗?zāi)Ｐ?，因此任何模型都不可能充分反映藥物的全面藥理作用；其次，用于高通量篩選的模型是有限的和不斷發(fā)展的，要建立反映機體全部生理機能或藥物對整個機體作用的理想模型，也是不現(xiàn)實的。但我們應(yīng)該相信，任何技術(shù)的進步，都將為科學(xué)的發(fā)展起到促進作用。隨著我們對高通量篩選研究的不斷深入，隨著對篩選模型的評價標(biāo)準(zhǔn)、新的藥物作用靶點的研究和發(fā)現(xiàn)以及對篩選模型的新穎性和實用性的統(tǒng)一，高通量篩選這一藥物篩選新技術(shù)必將在未來的藥物研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

22.高通量藥物篩選一，概念

高通量篩選(Highth生物制藥的發(fā)展歷史60年代以來，從生物體內(nèi)分離純化酶制劑的技術(shù)日趨成熟，酶類藥物得到廣泛應(yīng)用。

70年代開始研究應(yīng)用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物藥物。

1983年，日本首先實現(xiàn)了紫草細胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)紫草素。80年代，人們開始認識到微生物除了能生產(chǎn)抗生素外，還能產(chǎn)生酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)和作用于神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、抗組胺、消炎的藥物。23.生物制藥的發(fā)展歷史60年代以來，從生物體內(nèi)分離純化酶制生物制藥的發(fā)展歷史1982年，第一個基因工程藥物人胰島素上市。10年后，已上市的基因工程活性肽、活性蛋白已有19種。80年代末和90年代初，基因治療和糖鏈工程開始進入實用化發(fā)展時期。生物制藥理論的另一重大認識就是認識到生物多樣性對生物制藥的決定性影響，如高效抗癌藥紫杉醇的發(fā)現(xiàn)來自偶然。另外，人類基因庫的多樣性為尋找疾病基因，從而為以后的新藥研制與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。24.生物制藥的發(fā)展歷史1982年，第一個基因工程藥物人胰島素上市我國自70年代末80年代初開始進行現(xiàn)代生物技術(shù)的研究與開發(fā)。我國在基因工程和細胞工程技術(shù)方面的研究水平與國外先進水平相比差距已不大，中下游技術(shù)有了很大的進展，國內(nèi)已建立了40多個臨床藥理試驗基地，若干個生物工程中試基地。大中型制藥企業(yè)已開始投人開發(fā)。生物技術(shù)藥品開始實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。25.我國自70年代末80年代初開始進行現(xiàn)代生物技術(shù)的研生物制藥的發(fā)展歷史1996統(tǒng)計資料表明：研究開發(fā)的生物技術(shù)藥物品種63%在北美，25%在歐洲，7%在日本，5%在世界其它地方。生物技術(shù)藥品市場45%在美國，28%在歐洲，37%在世界各地，通過對各國生物技術(shù)及其產(chǎn)品的專利申請分析進一步表明歐美在生物技術(shù)的研究開發(fā)中占有很大比重。26.生物制藥的發(fā)展歷史1996統(tǒng)計資料表明：研究開發(fā)的生物技術(shù)藥表1世界生物技術(shù)專利分布

27.表1世界生物技術(shù)專利分布

27.生物制藥的發(fā)展歷史

衛(wèi)生部科技司于修成對全國除西藏以外的３０個省份衛(wèi)生系統(tǒng)中有條件開展生物技術(shù)的單位最近５～１０年（截至２００４年）的研究現(xiàn)況進行了問卷調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，我國各地區(qū)生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展不平衡，與各地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展水平呈正相關(guān)；研究人才梯隊已經(jīng)初步形成，結(jié)構(gòu)比較合理，學(xué)科帶頭人以國內(nèi)培養(yǎng)占據(jù)絕對優(yōu)勢；項目資金投入相差很大，總體上投入力度不夠，政府資金支持仍居主導(dǎo)地位；自主開發(fā)項目的專利申請數(shù)量很少，反映出專利意識不強；各地區(qū)對生命倫理認知有明顯差異，半數(shù)以上單位未設(shè)立醫(yī)學(xué)倫理委員會。從研究文獻發(fā)表情況看，我國干細胞研究文獻數(shù)量已經(jīng)接近美國，基因治療和組織工程方面研究文獻量已經(jīng)超過美國，但基因診斷文獻量遠遠落后于美國。

28.生物制藥的發(fā)展歷史衛(wèi)生部科技司于修成對全國除西藏以外生物制藥的研究內(nèi)容

(1)發(fā)酵工程制藥(2)基因工程制藥(3)細胞工程制藥(4)酶工程制藥29.生物制藥的研究內(nèi)容29.發(fā)酵工程制藥

發(fā)酵工程制藥是指利用微生物代謝過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。此類藥物有抗生素、維生素、氨基酸、核酸有關(guān)物質(zhì)、有機酸、輔酶、酶抑制劑、激素、免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)以及其他生理活性物質(zhì)。主要研究微生物菌種篩選和改良、發(fā)酵工藝的研究、產(chǎn)品后處理即分離純化等問題。當(dāng)今重組DNA技術(shù)在微生物菌種改良中起著越來越重要的作用。30.發(fā)酵工程制藥發(fā)酵工程制藥是指利用微生物代謝過程生產(chǎn)藥物的技基因工程制藥基因工程制藥是指利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽類藥物。這些藥物常是一些人體內(nèi)的活性因子，如干擾素、胰島素、白細胞介素2、EPO等。主要研究相應(yīng)基因的鑒定、克隆、基因載體的構(gòu)建與導(dǎo)入、目的產(chǎn)物的表達及分離純化等問題。現(xiàn)在正興起的基因治療是這—技術(shù)的一個新領(lǐng)域。1989年，我國批準(zhǔn)了第一個在我國生產(chǎn)的基因工程藥物——重組人干擾素αlb，標(biāo)志著我國生產(chǎn)的基因工程藥物實現(xiàn)了零的突破。重組人干擾素αlb是世界上第一個采用中國人基因克隆和表達的基因工程藥物，也是我國自主研制成功的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程一類新藥。31.基因工程制藥基因工程制藥是指利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多

細胞工程制藥細胞工程制藥是利用動、植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的技術(shù)。利用動物細胞培養(yǎng)可生產(chǎn)人類生理活性因子、疫苗、單克隆抗體等產(chǎn)品；利用植物細胞培養(yǎng)可大量生產(chǎn)經(jīng)濟價值較高的植物有效成分，也可生產(chǎn)人活性因子、疫苗等重組DNA產(chǎn)品?，F(xiàn)今重組DNA技術(shù)已用來構(gòu)建能高效生產(chǎn)藥物的動、植物細胞株系或構(gòu)建能產(chǎn)生原植物中沒有的新結(jié)構(gòu)化合物的植物細胞系。它主要研究動、植物細胞高產(chǎn)株系的篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及產(chǎn)物的分離純化等問題。32.細胞工程制藥細胞工程制藥是利用動、植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的酶工程制藥酶工程制藥是將酶或活細胞固定化后用于藥品生產(chǎn)的技術(shù)。它除了能全程合成藥物分子外，還能用于藥物的轉(zhuǎn)化，如我國成功地利用微生物兩步轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)維生素C。它主要研究酶的來源、酶(或細胞)固定化、酶反應(yīng)器及相應(yīng)操作條件等。酶工程生產(chǎn)藥物具有生產(chǎn)工藝結(jié)構(gòu)緊湊、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高，產(chǎn)物回收容易，可重復(fù)生產(chǎn)等優(yōu)點。酶工程作為發(fā)酵工程的替代者，其應(yīng)用具有廣闊的前景。33.酶工程制藥酶工程制藥是將酶或活細胞固定化后用于藥品生產(chǎn)的技術(shù)生物技術(shù)制藥的特性高技術(shù)高投入長周期高風(fēng)險高收益34.生物技術(shù)制藥的特性高技術(shù)34.三、新型生物藥物研制的理論和方法（一）概述（二）新藥研究和開發(fā)的主要過程（三）先導(dǎo)化合物的尋找35.三、新型生物藥物研制的理論和方法35.（一）概述新型生物藥物是指利用生物體或生物過程產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎的藥物。結(jié)構(gòu)新穎是指與以前藥物有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是一種新的化學(xué)實體(Newchemicalentity，簡稱NCE)。這類新型生物藥物國家認定為一類新藥。國際上所說的新藥開發(fā)就是指開發(fā)NCE藥物。36.（一）概述新型生物藥物是指利用生物體或生物過程產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎生物藥物分類根據(jù)NCE來源分一類是利用重組DNA技術(shù)，向大腸桿菌、酵母、動物、植物細胞中導(dǎo)入目的基因，構(gòu)建重組細胞，生產(chǎn)目的基因編碼的蛋白質(zhì)類、多肽類藥物或疫苗，或?qū)⒁恍┨厥饣蚣盎蚱螌?dǎo)入宿主細胞后使宿主細胞產(chǎn)生原來不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，獲得新功能，或阻遏宿主細胞基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，抑制其功能，甚至殺死宿主細胞，這就是常說的基因治療。另一類是利用微生物、動植物或酶生產(chǎn)的非上述藥品，通過篩選可獲得這類新藥的NCE的先異物(Leadcompound)。這類藥物種類繁多，包括傳統(tǒng)的利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的藥物和直接從動植物中提取的天然藥品等。37.生物藥物分類根據(jù)NCE來源分37.（二）新藥研究和開發(fā)的主要過程(1)確定研究計劃要綜合考慮醫(yī)療、市場、化學(xué)的評估，文獻狀況，專利的檢索，結(jié)構(gòu)的選擇，合成的前景等因素。(2)準(zhǔn)備化合物文獻研究，合成或分離，結(jié)構(gòu)鑒定，標(biāo)準(zhǔn)化，專利申請，對研究目標(biāo)的復(fù)核等。以上兩個環(huán)節(jié)需占用l～2年的時間，需準(zhǔn)備6000～8000個化合物供篩選。38.（二）新藥研究和開發(fā)的主要過程(1)確定研究計劃要綜合(3)藥理篩選。(4)化學(xué)試驗活性成分的分析。(5)臨床前Ⅰ期(PreclinicalI)進一步藥理研究包括毒性(2種動物)及活性成分的穩(wěn)定性。(6)臨床前Ⅱ期(PreclinicalⅡ)進一步藥理研究包括亞急性毒性(2種動物)、畸胎學(xué)研究、藥物動力學(xué)、動物體內(nèi)的吸收和排泄、劑型的研究與開發(fā)、包裝與保存期的研究。以上幾個環(huán)節(jié)占用2～3年的時間，化合物分別剩下大約20個、18個和12個。39.(3)藥理篩選。39.(10)注冊申請上市經(jīng)政府藥政部門批準(zhǔn)后提供治療應(yīng)用。這一過程需2～3年。(11)售后監(jiān)測(Post－marketingsurveillance)根據(jù)情況進行藥理試驗、毒性試驗、特殊試驗和藥物動力學(xué)試驗；對副作用的報告進行收集、評價和鑒別；對藥品生產(chǎn)進行質(zhì)量控制，制劑的生產(chǎn)和包裝?？梢姡粋€新藥的問世要提供6000～8000個化學(xué)物質(zhì)．經(jīng)歷9～13年的時間，耗資約2.3億美元。系統(tǒng)性從縱的方面看主要是若干個環(huán)節(jié)緊密的銜接和重疊，橫的方向主要表現(xiàn)為多種學(xué)科相互之間的滲透性和協(xié)同性。40.(10)注冊申請上市經(jīng)政府藥政部門批準(zhǔn)后提供治療應(yīng)用。（三）先導(dǎo)化合物的尋找在整個新藥的研究和開發(fā)中，先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)是決定以后研究與開發(fā)的首要因素，要找到一個好的先導(dǎo)化合物，需要建立好的篩選模型和尋找盡可能多的化合物來源。先導(dǎo)化合物的篩選是一項復(fù)雜的系統(tǒng)工程，常需要對幾個學(xué)科同時進行研究。41.（三）先導(dǎo)化合物的尋找在整個新藥的研究和開發(fā)中，先先導(dǎo)化合物是指具有某種生物活性的化學(xué)結(jié)構(gòu),由于其活性不強,選擇性低,吸收性差,或毒性較大等缺點,不能直接藥用。但作為新的結(jié)構(gòu)類型和線索物質(zhì),對其進行結(jié)構(gòu)變換和修飾,可得到具有優(yōu)良藥理作用的藥物。

42.先導(dǎo)化合物是指具有某種生物活性的化學(xué)結(jié)構(gòu),由于其活性不強,選43.43.先導(dǎo)化合物的尋找1．篩選模型的確定2.先導(dǎo)化合物來源44.先導(dǎo)化合物的尋找1．篩選模型的確定2.先導(dǎo)化合物來源44

1．篩選模型的確定篩選模型的核心是藥物作用靶，如細菌、動物、酶和細胞表面受體等。(1)用動物細胞和組織建立的篩選模型(2)酶抑制劑的篩選(3)受體拮抗劑的篩選45.1．篩選模型的確定45.篩選模型(1)用動物細胞和組織建立的篩選模型其中包括下列物質(zhì)的篩選：①抗腫瘤活性物質(zhì)：觀察細胞形態(tài)的變化，測定體外細胞毒性LC50值。②免疫抑制劑：測定對淋巴細胞增殖反應(yīng)的抑制作用。③神經(jīng)營養(yǎng)因子樣物質(zhì)：以神經(jīng)細胞的分化，如以神經(jīng)軸突的伸長為指標(biāo)。④血管生成抑制劑：以雞絨毛膜尿囊膜和動物角膜為材料，觀察對新血管生成的抑制作用。46.篩選模型(1)用動物細胞和組織建立的篩選模型其中包括下篩選模型(2)酶抑制劑的篩選

已經(jīng)建立了大量的酶抑制劑的篩選模型，主要有以下6種：（抗癌、抗病毒）蛋白分解酶抑制劑細胞膜酶抑制劑糖苷水解酶抑制劑兒茶酚胺合成酶抑制劑膽固醇生物合成酶HMG—CoA還原酶抑制劑其他酶抑制劑。47.篩選模型(2)酶抑制劑的篩選47.篩選模型(3)受體拮抗劑的篩選其中包括下列拮抗物質(zhì)的篩選：①速激肽(Tachykinin，TK)：以3H標(biāo)記的物質(zhì)與其受體結(jié)合的抑制率為指標(biāo)。②內(nèi)皮素(Endothelin，ET)：觀察內(nèi)皮素使血管收縮與其受體結(jié)合的抑制率。心血管系統(tǒng)疾?、劭s膽囊素(Cholecystokinin，CCK)：以125I標(biāo)記的CCK與其受體結(jié)合的抑制率為指標(biāo)。④心房納利尿肽(ANP)：以125I標(biāo)記的ANP與其受體結(jié)合的抑制率為指標(biāo)。

48.篩選模型(3)受體拮抗劑的篩選其中包括下列拮抗物質(zhì)的篩選篩選模型⑤興奮性氨基酸(EAA)：觀察EAA與其受體結(jié)合的抑制率。⑥白三烯B4(LTB4)：以人多形核白細胞(PMN)為LTB4的受體，觀察其抑制率。⑦其他激素受體與C5a現(xiàn)今篩選靶已擴展到基因水平，開始考慮以基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄因子、凋亡基因為治療的對象。49.篩選模型⑤興奮性氨基酸(EAA)：觀察EAA與其受體結(jié)合的抑2.先導(dǎo)化合物來源從化學(xué)庫或天然產(chǎn)物中篩選

化學(xué)庫是指用特殊合成方式隨機合成結(jié)構(gòu)多樣的化合物群體，它的多樣性可以得到較充分的保證，但不能得到結(jié)構(gòu)獨特的化合物。與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)設(shè)計（合理新藥設(shè)計）

合理藥物設(shè)計(理性的藥設(shè)計)則是基于受體三維立體結(jié)構(gòu)的認識，通過計算機輔助分子設(shè)計(Computeraidmoleculardesign)全程合成新分子。50.2.先導(dǎo)化合物來源從化學(xué)庫或天然產(chǎn)物中篩選50.先導(dǎo)化合物來源現(xiàn)今從生物中篩選新藥重點放在微生物?；衔锏亩鄻有耘c以下有關(guān)：微生物的種：決定微生物合成的潛在能力；發(fā)酵條件：調(diào)整發(fā)酵參數(shù)可以巧妙地促進不同次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生；地理區(qū)域；生態(tài)學(xué)環(huán)境：最好收集新鮮的野生菌種。51.先導(dǎo)化合物來源現(xiàn)今從生物中篩選新藥重點放在微生先導(dǎo)化合物來源除了微生物外，現(xiàn)在人們也開始關(guān)注植物、動物和海洋生物。

植物方面，尋找人們所使用的藥用植物，增加新藥發(fā)現(xiàn)的機會。在人類和動物方面，則關(guān)注自身免疫系統(tǒng)。已從人類和動物的吞噬細胞中分離得到許多具潛在抗菌作用的蛋白質(zhì)和多肽。它們有望用作抗菌藥物。52.先導(dǎo)化合物來源除了微生物外，現(xiàn)在人們也開始關(guān)注植物、先導(dǎo)化合物來源

海洋生物可為新化合物的篩選提供豐富的資源。目前，海洋天然產(chǎn)物的研究集中在大型固著無脊椎動物和藻類上，因為這些生物相對容易識別和采集。注意：新藥的研究與開發(fā)不是先導(dǎo)物與新藥的一一對應(yīng)關(guān)系。新藥的研究與開發(fā)是一個將化學(xué)結(jié)構(gòu)研究與生物活性研究連接起來的創(chuàng)造性過程，是不斷地對初始治療概念進行發(fā)展和完善的過程。53.先導(dǎo)化合物來源海洋生物可為新化合物的篩選提供豐富的資四、生物制藥技術(shù)新進展（一）人類基因組研究與未來藥學(xué)（二）抗體工程（三）轉(zhuǎn)基因技術(shù)（四）海洋藥物(五)生物技術(shù)制藥工業(yè)發(fā)展動態(tài)54.四、生物制藥技術(shù)新進展（一）人類基因組研究與未來藥學(xué)54.（一）人類基因組研究與未來藥學(xué)人類現(xiàn)有的2035類，18000種疾病，都直接或間接與基因有關(guān)。可分為三大類，單基因疾病、多基因病、獲得性基因病。人類基因組的研究成果、可以大大提高人類對基因受損和人類疾病的關(guān)系的了解，從以下幾方面促進未來藥學(xué)的發(fā)展。(1)基因診斷基因圖譜的最大最直接用途當(dāng)屬醫(yī)療診斷，特別像心臟病等源于遺傳基因變異的疾病。(2）基因治療基因治療是指將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入載體或受體細胞，通過替代缺陷基因、修正錯誤基因，對抗異?；?，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的表達方式以實現(xiàn)治療疾病目的的一種治療方法。人們可以根據(jù)引起疾病的基因缺陷，通過定向糾正、替換那些錯誤基因，達到治病的目的。55.（一）人類基因組研究與未來藥學(xué)人類現(xiàn)有的2035類，180(3)基因組藥物學(xué)通過研究個體對包括藥物在內(nèi)的外界化學(xué)物質(zhì)（有毒外源物)反應(yīng)的遺傳多樣性和差異性，達到科學(xué)合理用藥的目的。(4)發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的蛋白質(zhì)和多肽類藥物。(5)提供大量藥物作用新的靶點，供新藥的篩選、研究用。56.(3)基因組藥物學(xué)通過研究個體對包括藥物在內(nèi)的外界化學(xué)（二）抗體工程1.抗體工程的發(fā)展

多克隆抗體：將某種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，成熟的B細胞克隆受到抗原刺激后，便產(chǎn)生抗體并將之分泌到血清和體液中，這種抗體實際上是一種混合物；單克隆抗體：1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的針對某一特定抗原決定簇的單克隆抗體，即第二代抗體或細胞工程抗體，但具有鼠源性，進入人體后會引起人抗抗體反應(yīng)(HAMA反應(yīng))；57.（二）抗體工程1.抗體工程的發(fā)展57.基因工程抗體：將抗體的基因按不同需要進行改造和重組，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中進行表達，便產(chǎn)生了第三代抗體－基因工程抗體?；蚬こ炭贵w的優(yōu)點58.基因工程抗體：將抗體的基因按不同需要進行改造和重組，然后導(dǎo)入2．基因工程抗體的優(yōu)點（與單克隆抗體相比）（1）通過基因工程技術(shù)改造，可以降低抗體的免疫原性，使抗體人源化，消除HAMA反應(yīng)；（2）基因工程抗體的分子質(zhì)量一般較小，更利于穿透血管壁，進入病灶的核心部位，從而改善其體內(nèi)藥代動力學(xué)性質(zhì)；（3）利用抗體庫技術(shù)，不需用抗原免疫動物便可以獲得針對任何一種抗原決定簇的抗體，甚至制備出用單克隆抗體技術(shù)無法實現(xiàn)的新型抗體：（4）可以采用原核、真核表達系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)出大量的基因工程抗體，降低了生產(chǎn)成本。59.2．基因工程抗體的優(yōu)點（與單克隆抗體相比）59.3．基因工程抗體的種類基因工程抗體主要分兩大類，即大分子抗體和小分子抗體。前者目的是使鼠單抗人源化；而后者則是使抗體具有更好的通透性，易于到達靶部位。4．其他形式的抗體衍生物(1）雙特異性抗體(2)雙功能抗體(3)抗體酶（4）抗體庫技術(shù)60.3．基因工程抗體的種類60.抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)的主導(dǎo)思想是將某種動物的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)?；蚴删w中表達，利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應(yīng)的特異性抗體。61.抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)的主導(dǎo)思想是將某種動物的所有抗體可變區(qū)基抗體庫技術(shù)

Winter等人于1994年建立了噬菌體抗體庫技術(shù)，它是抗體工程研究領(lǐng)域的一次飛躍。在這之前，基因工程抗體技術(shù)只能對已有的單抗進行改造，而抗體庫技術(shù)的誕生卻可以不通過動物免疫和細胞融合便可以從抗體庫中篩選得到全新的人源化的抗體，并通過細菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)出來?？贵w庫技術(shù)的發(fā)展使得抗體工程技術(shù)進入了一個全新的時期。62.抗體庫技術(shù)Winter等人于1994年建立了噬菌體抗（三）轉(zhuǎn)基因技術(shù)1轉(zhuǎn)基因動物制藥

轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal)就是某種目的基因?qū)氲讲溉閯游锏氖芫鸦蚺咛ダ?，使?dǎo)入的基因與受精卵的染色體DNA整合在一起，當(dāng)細胞分裂時，隨著染色體的倍增，該目的基因也隨之倍增，這樣每個細胞里就都帶有導(dǎo)入的基因，而且能穩(wěn)定地遺傳到下一代，這樣一種新的個體，稱之為轉(zhuǎn)基因動物。已在以下動物的奶汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥物：牛奶中有抗凝血酶、纖維蛋白原、人白血清蛋白、膠原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等；山羊奶中有抗凝血酶原、α-抗胰蛋白酶(α-AT)、生育激素、血清白蛋白、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、單克隆抗體；綿羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子、纖維蛋白原、蛋白質(zhì)C；豬奶中亦有蛋白質(zhì)C、凝血因子、纖維蛋白原、血紅蛋白。63.（三）轉(zhuǎn)基因技術(shù)1轉(zhuǎn)基因動物制藥63.（三）轉(zhuǎn)基因技術(shù)2轉(zhuǎn)基因植物制藥利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白，這是最近十幾年來發(fā)展起來的一個值得關(guān)注的研究領(lǐng)域。目前科學(xué)家已較成功地采用了番茄、馬鈴薯、萵苣、香蕉等轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗，這樣一方面可以避免或至少減免部分純化過程，從而大大降低生產(chǎn)成本，另一方面人們只需食用這種轉(zhuǎn)基因食品就可以獲得滿意的免疫效果，既方便又便宜，而且很安全。64.（三）轉(zhuǎn)基因技術(shù)2轉(zhuǎn)基因植物制藥64.（四）海洋藥物海洋生物資源具有廣闊的綜合利用前景，從海洋生物體內(nèi)獲取有功效的初生代謝產(chǎn)物與次生代謝產(chǎn)物，可發(fā)展海洋藥物，海洋生物保健品、海洋生物化工產(chǎn)品。國際上已研制出一些具有特殊療效的海洋藥物和海洋功能食品。我國于1996年正式啟動國家海洋“863”計劃，海洋生物技術(shù)作為其中的主題之一。新型抗艾滋病海洋藥物911已完成了臨床前藥學(xué)、藥效學(xué)和毒理學(xué)研究，已獲準(zhǔn)進入I期臨床試驗，成為我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的第一個抗艾滋病藥物。抗腫瘤新藥K-001也已完成了全部臨床前研究。甲殼質(zhì)衍生物916抗動脈粥樣硬化新藥已申報了臨床研究等等。65.（四）海洋藥物