昆明景潤食品有限公司作業(yè)指導(dǎo)書文件號:KJWI-QA-27版本:A/1日期:2012-05-25 頁數(shù):PagePAGE1ofNUMPAGES12標題：大腸菌群計數(shù)方法編寫:楊紅梅審核:馬莉鴻批準：伏麗玲文件修改記錄版本修訂次數(shù)修訂日期修訂內(nèi)容002011-02-14A12012-05-25修訂分發(fā)號:______(僅適用于控制文件)(僅蓋有紅色印章的文件才有效)目的規(guī)定大腸桿菌計數(shù)的方法。適用范圍適用于加多寶涼茶、濃縮汁或原輔材料中的大腸桿菌群的計數(shù)。術(shù)語大腸菌群：一群在36℃條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧格蘭仕隱形無芽孢桿菌。MPN最可能數(shù)（mostprobablenumber）：基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。職責(zé)質(zhì)檢部：負責(zé)按此方法對加多寶來涼茶、濃縮汁或原輔材料中大腸菌群進行計數(shù)。流程圖見附錄A、附錄B。內(nèi)容及要求設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃冰箱：2℃-5℃恒溫水浴箱：46℃±1℃天平：感量0.1g振蕩器無菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸頭。無菌錐形瓶：容量500ml無菌試管：18×200ml小導(dǎo)管無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm菌落計數(shù)器培養(yǎng)基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯煌綠乳糖膽鹽（BGLG）肉湯乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（LBB）乳糖蛋白胨培養(yǎng)基（LPB）伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB）結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）75%乙醇溶液無菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min大腸菌群MPN計數(shù)法加多寶涼茶、濃縮汁等產(chǎn)品及原輔材料中大腸菌群的測定樣品稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置于盛有225ml無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1-2min，制成1：10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品置于盛有225ml的無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1：10的樣品勻液。用1ml無菌吸管吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注入盛有9ml無菌生理鹽水的試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管，制成1：100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的分析，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。注意每遞增稀釋一次，換用一支1ml無菌吸管。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1ml（如果接種量超過1ml，則用雙料LST肉湯）。將以上接種好的試管置于36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進行復(fù)發(fā)酵試驗。復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從所有48±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄C），報告每克（或每毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。工藝水等水樣中大腸菌群的測定推測性試驗取待檢樣品10ml，接種到10ml雙料的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液或乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，共接種5管；對于可能存在污染的水源，取待檢樣品10ml、1ml、0.1ml（取樣品1ml于9ml無菌生理鹽水中稀釋，取稀釋后的樣液1ml），分別接種于含10ml雙料、單料和單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液或乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，各接種5管。如果水樣污染較嚴重，應(yīng)加大稀釋度，可接種1ml、0.1ml、0.01ml甚至0.1ml、0.01ml、0.001ml，每個稀釋度接種5管，每個水樣共接種15管。接種1ml以下水樣時，必須做10倍遞增稀釋后，取1ml接種，每遞增稀釋一次，換用1支1ml無菌刻度吸管。將以上接種好的試管置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管或乳糖蛋白胨發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。確證性試驗方法一分離培養(yǎng)將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，置于36±1℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18-24h取出。觀察菌落形態(tài)，用接種環(huán)挑取符合下列特征的菌落作革蘭氏染色、鏡檢和證實試驗。菌落呈深紫黑色，表面有金屬光澤；紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色、中心較深的菌落。證實試驗經(jīng)上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時接種乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，置于36±1℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24±2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有大腸菌群存在。方法二自推測性檢驗陽性管中取1接種環(huán)培養(yǎng)液，接種到煌綠乳糖膽鹽（BGLG）肉湯管中，置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。觀察BGLG管中的產(chǎn)氣情況，如有氣體產(chǎn)生，就可確定為大腸菌群陽性，如無氣體產(chǎn)生則為大腸菌群陰性。結(jié)果報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，可得出水樣中大腸菌群的MPN值。5管法見附錄F，15管法結(jié)果見附錄E。稀釋樣品查表后所得結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均為陰性時，可報告大腸菌群未檢出。大腸菌群平板計數(shù)法樣品稀釋按6.3.1.1執(zhí)行平板計數(shù)選取1-3個適宜的稀釋度（液體樣品可以選用原液）接種兩個無菌平皿，每皿1ml，同時分別取1ml無菌生理鹽水加入到兩個無菌平皿作空白對照。及時將冷卻至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）15-20ml傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后再加3-4ml結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h。用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。選取菌落數(shù)在15CFU-150CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑的大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.55mm或更大。證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24-48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。平板計數(shù)法的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以6.4.2.3中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或每毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1ml，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×（6/10）×104g（ml）=6.0×105CFU/g（CFU/ml）質(zhì)量記錄7.1KJWIF-QA-34《成品檢測記錄》附錄A大腸菌群MPN計數(shù)檢驗程序檢樣檢樣25g（25ml）樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇適宜三個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管36℃±1℃48h±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣BGLB肉湯36℃±1℃48h±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性查ＭＰＮ表報告結(jié)果附錄Ｂ大腸菌群平板計數(shù)檢驗程序檢樣檢樣25g（25ml）樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)１０倍系列稀釋選擇2——3個適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板36℃±1℃18—24h計數(shù)典型和可疑菌落BGLB肉湯或復(fù)發(fā)酵試驗36℃±1℃24—48h報告結(jié)果附錄C大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表每克（或每毫升）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的檢索見下表：陽性管數(shù)MPN95%可信限陽性管數(shù)MPN95%可信限0.10.010.001下限上限0.10.010.001下限上限000<3.0—9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.638310？91801107.41.3203117517200111113.63831212037420120113.64231316040420121154.5423209318420130164.542321150374202009.21.43832221040430201143.642323290901000202204.542330240421000210153.742331460902000211204.54233211001804100212278.794333>1100420—注1：本表采用3個稀釋度［0.1g（或0.1ml）、0.01g（或0.01ml）和0.001g（或0.001ml）］，每個稀釋度接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g（或1ml）、0.1g（或0.1ml）和0.01g（或0.01ml）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍，如改用0.01g（或0.01ml）、0.001g（或0.001ml）、0.0001g（或0.0001ml）時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。附錄D大腸菌群MPN檢索表（用5管10ml水樣時各種陽性和陰性結(jié)果組合的MPN值及其95%的可信限）陽性反應(yīng)管數(shù)MPN/100ml95%可信限下限上限000612.20.112.625.10.519.239.21.629.44163.352.95>168無限附錄E大腸菌群MPN檢索表（總接種量55.5ml，其中5份10ml水樣，5份1ml水樣，5份0.1ml水樣）接種量/ml大腸菌群（MPN/100ml）接種量/ml大腸菌群（MPN/100ml）1010.11010.1000<210020012101400241026003510380047104100059105120102110401141116012611280137113100149114120151111514