第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測Ppt第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測Ppt1免疫細胞的分離及檢測※檢測：各類免疫細胞及其亞群的數(shù)量和功能測定※方法：體外法為主※目的：判斷機體免疫狀態(tài)※意義：探討疾病的發(fā)病機制、發(fā)展、預(yù)后、療效免疫細胞的分離是指將各種參與免疫反應(yīng)的細胞從血液或組織中分離出來2免疫細胞的分離及檢測※檢測：各類免疫細胞及其亞群的數(shù)量和功能第一節(jié)免疫細胞的分離外周血單個核細胞分離淋巴細胞的分離T細胞和B細胞的分離T細胞亞群的分離第一節(jié)免疫細胞的分離外周血單個核細胞分離3細胞分離基本原理不同細胞密度不同不同細胞生物學(xué)特性不同不同細胞表面分化抗原不同細胞分離基本原理不同細胞密度不同4一、外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞（monocyte）。

聚蔗糖-泛影葡胺聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒一、外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞（peripher5原理外周血中各細胞的比重不同，PBMC的比重為1.075～1.090，紅細胞和多核細胞分別為1.093和1.092，選擇比重為1.077±0.001的介質(zhì)，細胞與介質(zhì)混合后離心，比重比介質(zhì)大的紅細胞和多核細胞沉降在下層，而PBMC位于Ficoll分離液上層。

原理外周血中各細胞的比重不同，PBMC的比重為1.075～16用1.077±0.001的分層液可分離人外周血單個核細胞Ficoll分離液２份6%聚蔗糖蒸餾水溶液１份34%泛影葡胺生理鹽水溶液(聚蔗糖-泛影葡胺）Ficoll外周血用1.077±0.001的分層液可分離人外周血單個核細胞7對分離介質(zhì)的要求：對細胞無毒；等滲；與血漿和分離細胞不相溶；有特定的比重。不同動物的PBMC比重有差異：小鼠：1.085大鼠：1.087人：1.075～1.090對分離介質(zhì)的要求：對細胞無毒；不同動物的PBMC比重有差異：8T細胞和B細胞的分離熒光激活細胞分離儀分離法第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測Ppt對分離介質(zhì)的要求：對細胞無毒；CD35（C3b/C4b受體）第一節(jié)免疫細胞的分離聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒Percoll分離液法２份6%聚蔗糖蒸餾水溶液CD19（B細胞的標(biāo)志）※目的：判斷機體免疫狀態(tài)SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標(biāo)志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標(biāo)。方法學(xué)評價：分離得到的PBMC純度可達９５％，第一節(jié)免疫細胞的分離CD3+CD4+CD8輔助性T細胞（helpTcell,Th）（helpTcell,Th）※檢測：各類免疫細胞及其亞群的數(shù)量和功能測定方法學(xué)評價：分離得到的PBMC純度可達９５％，淋巴細胞占９０％～９５％；操作簡便；易于無菌。

T細胞和B細胞的分離方法學(xué)評價：分離得到的PBMC純度可達９9二、淋巴細胞分離貼壁粘附法吸附柱過濾法Percoll分離液法（連續(xù)密度梯度離心）二、淋巴細胞分離貼壁粘附法10利用單核細胞具有貼壁生長的特點，將已制備的單個核細胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平培養(yǎng)瓶，37℃溫箱靜置1h，單核細胞將貼附于平皿壁上，而未貼壁的細胞幾乎全為純淋巴細胞。橡皮棒刮下貼壁的細胞，可得純單核細胞(無活性）。1.貼壁黏附法PBMC37℃°1hour上清液單核單核淋巴細胞注意：B細胞也可粘附利用單核細胞具有貼壁生長的特點，將已制備的單個核細胞懸11利用單核細胞具有貼壁生長的特點，將單個核細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的層析柱中，凡有黏附能力的細胞絕大部分被吸附而黏滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細胞主要是淋巴細胞。2.吸附柱過濾法PBMC洗脫洗脫液淋巴細胞單核細胞>DC>B細胞>T細胞細胞的粘附能力：利用單核細胞具有貼壁生長的特點，將單個核細胞懸液注入123.Percoll分離液法Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細胞無毒性。采用預(yù)先形成的密度梯度，分離的細胞輕輕疊加到液面上Percoll液經(jīng)離心后可形成一個從管底到液面逐漸遞減的連續(xù)的密度梯度，不同密度的細胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶，從而將密度不等的細胞分離純化。死細胞血小板單核細胞淋巴細胞粒細胞紅細胞3.Percoll分離液法Percoll是一種經(jīng)聚乙烯13三、T、B細胞和T細胞亞群

的分離磁性微球分離法熒光激活細胞分離儀分離法

三、T、B細胞和T細胞亞群

的分離磁性微球分離法141.磁性微球分離法磁性微球：金屬小顆粒（Fe2o3,Fe3o4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基團（氨基、羧基和羥基），可結(jié)合生物大分子物質(zhì)（抗原，抗體，核酸等）。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物質(zhì)稱免疫磁珠。1.磁性微球分離法磁性微球：金屬小顆粒（Fe2o3,Fe15此法簡便快速，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，T細胞純度可達90%以上。三、自然殺傷細胞表面標(biāo)志的檢測缺點：不適用于細胞表面分子不清的細胞分離，試劑和儀器昂貴※目的：判斷機體免疫狀態(tài)如需短期保存，置4℃放置較好，可減低細胞代謝活動。一、外周血單個核細胞分離對保存液的要求等滲，具pH緩沖作用，并對細胞無毒性（Hanks、Tc199、RPMI1640）。２份6%聚蔗糖蒸餾水溶液１份34%泛影葡胺生理鹽水溶液第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測Ppt如需短期保存，置4℃放置較好，可減低細胞代謝活動。組織中分離出來等滲；細胞活力常用活細胞占總細胞的百分比表示，細胞活力的測定常用的簡便方法是臺盼藍(trypanblue)染色法。免疫磁珠：微球表面包被有免疫物質(zhì)稱免疫磁珠。CD19/CD5分子可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。熒光激活細胞分離儀分離法※檢測：各類免疫細胞及其亞群的數(shù)量和功能測定第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測PptCD3+CD4CD8+細胞毒性T細胞此法簡便快速，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，T細胞純度16第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測實用課件實用課件17流式細胞分析儀2.熒光激活細胞分離儀分離法流式細胞分析儀2.熒光激活細胞分離儀分離法18E花環(huán)沉降法尼龍毛柱分離法T細胞和B細胞的分離E花環(huán)沉降法T細胞和B細胞的分離191.E花環(huán)沉降法（E受體/CD2與綿羊紅細胞結(jié)合）B細胞T細胞Ficoll液離心溶解紅細胞T細胞B細胞1.E花環(huán)沉降法（E受體/CD2與綿羊紅細胞結(jié)合）B細胞202.尼龍毛柱分離法此法簡便快速，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，T細胞純度可達90%以上。2.尼龍毛柱分離法此法簡便快速，不需特殊儀器，淋巴細胞活性21第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測實用課件實用課件22四、不同細胞分離方法的綜合評價早期細胞物理屬性細胞生物屬性分辨率和靈敏度不高現(xiàn)在（根據(jù)細胞表面標(biāo)志）免疫磁珠流式細胞儀分辨率和靈敏度高缺點：不適用于細胞表面分子不清的細胞分離，試劑和儀器昂貴四、不同細胞分離方法的綜合評價早期細胞物理屬性細胞生物屬性分23五、分離細胞的保存和活力檢測1.分離細胞的保存對保存液的要求等滲，具pH緩沖作用，并對細胞無毒性（Hanks、Tc199、RPMI1640）。如需短期保存，置4℃放置較好，可減低細胞代謝活動。如需長期保存，應(yīng)放入液氮罐中在深低溫(196℃)條件下保存細胞。五、分離細胞的保存和活力檢測1.分離細胞的保存242.細胞活力測定細胞活力常用活細胞占總細胞的百分比表示，細胞活力的測定常用的簡便方法是臺盼藍(trypanblue)染色法。死細胞著色，染成藍色；活細胞拒染。用血細胞計數(shù)器在顯微鏡下觀察到著色和不著色的細胞，計數(shù)200個細胞，以不著色細胞的百分率即代表細胞的活力。2.細胞活力測定用血細胞計數(shù)器在顯微鏡下觀察到著色25一、T細胞表面標(biāo)志的檢測二、B細胞表面標(biāo)志的檢測四、細胞表面標(biāo)志檢測的意義

三、自然殺傷細胞表面標(biāo)志的檢測

第二節(jié)淋巴細胞標(biāo)志及亞群分類一、T細胞表面標(biāo)志的檢測二、B細胞表面標(biāo)志的檢測四、細胞表面26一、T細胞表面標(biāo)志及其亞群CD3+CD4+CD8輔助性T細胞（helpTcell,Th）CD3+CD4CD8+細胞毒性T細胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatoryTcell,TrorTreg）一、T細胞表面標(biāo)志及其亞群CD3+CD4+CD8輔助性T細27二、B細胞表面標(biāo)志

SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標(biāo)志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標(biāo)。CD19/CD5分子可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。二、B細胞表面標(biāo)志SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受28對分離介質(zhì)的要求：對細胞無毒；外周血單個核細胞分離（連續(xù)密度梯度離心）對保存液的要求等滲，具pH緩沖作用，并對細胞無毒性（Hanks、Tc199、RPMI1640）。不同細胞生物學(xué)特性不同死細胞著色，染成藍色；有特定的比重。如需短期保存，置4℃放置較好，可減低細胞代謝活動。淋巴細胞占９０％～９５％；第十三章免疫細胞分離及表面標(biāo)志檢測Ppt090，紅細胞和多核細胞分別為1.第一節(jié)免疫細胞的分離缺點：不適用于細胞表面分子不清的細胞分離，試劑和儀器昂貴（cytotoxicTcell,TcorCTL）橡皮棒刮下貼壁的細胞，可得純單核細胞(無活性）。１份34%泛影葡胺生理鹽水溶液等滲；易于無菌。一、外周血單個核細胞分離對保存液的要求等滲，具pH緩沖作用，并對細胞無毒性（Hanks、Tc199、RPMI1640）。四、細胞表面標(biāo)志檢測的意義CD19+CD5-:B2細胞SmIg：膜表面免疫球蛋白CD19（B細胞的標(biāo)志）CD21CD32(FcRⅡ)CD35（C3b/C4b受體）CD40（成熟B細胞）CD80/86（活化的B細胞）CD19+CD5+:B1細胞CD22和CD23二、B細胞表面標(biāo)志

對分離介質(zhì)的要求：對細胞無毒；CD19+CD5-:B2細胞S29三、NK細胞表面標(biāo)志人類NK細胞表面標(biāo)志主要以CD16、CD56來認(rèn)定，臨床上將CD3CD56+CD16+淋巴細胞認(rèn)定為NK細胞。三、NK細胞表面標(biāo)志人類NK細胞表面標(biāo)志主要以30淋巴細胞表面標(biāo)志檢測的臨床意義淋巴細胞表面標(biāo)志檢測是評價免疫功能的重要指標(biāo)。對CD4+和CD8+T細胞的測定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測。淋巴細胞表面標(biāo)志檢測的臨床意義淋巴細胞表面標(biāo)志檢測是評價免31大鼠：1.此法簡便快速，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，T細胞純度可達90%以上。有特定的比重。淋巴細胞占９０％～９５％；四、細胞表面標(biāo)志檢測的意義采用預(yù)先形成的密度梯度，分離的細胞輕輕疊加到液面上Percoll液經(jīng)離心后可形成一個從管底到液面逐漸遞減的連續(xù)的密度梯度，不同密度的細胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶，從而將密度不等的細胞分離純化。（helpTcell,Th）CD40（成熟B細胞）不同細胞生物學(xué)特性不同對保存液的要求等滲，具pH緩