專題基因工程1（2021年江蘇）某小組為研究真菌基因m的功能，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽的質(zhì)粒。請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問題。（1）目的基因的擴(kuò)增①提取真菌細(xì)胞，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進(jìn)一步獲得基因m片段。②為了獲得融合tag標(biāo)簽的蛋白M，設(shè)計(jì)引物P2時(shí)，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導(dǎo)致。③熱啟動(dòng)PCR可提高擴(kuò)增效率，方法之一是：先將除taqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加熱到80℃以上再混入酶，然后直接從94℃開始PCR擴(kuò)增。下列敘述正確的有Taq酶最適催化溫度范圍為50-60℃與常規(guī)PCR相比，熱啟動(dòng)PCR可減少反應(yīng)起始時(shí)引物錯(cuò)配形成的產(chǎn)物。兩條子鏈的合成一定都是5’端向3’端延伸。PCR產(chǎn)物DNA堿基序列的特異性體現(xiàn)了Taq酶的特異性（2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建①將Smal切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)，形成A-m結(jié)合體。將A-m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化。②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A-m,仍能被Smal切開，則Smal的酶切點(diǎn)可能在。（3）融合蛋白的表達(dá)①用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導(dǎo)入質(zhì)粒A-m,然后涂布于無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得的菌株，其機(jī)理是。②若通過(guò)抗原-抗體雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到酵母蛋白中含tag標(biāo)簽，說(shuō)明，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可借助tag標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。2.(2017·江蘇卷)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白,某研究小組計(jì)劃通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌,用于重金屬?gòu)U水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下,請(qǐng)回答下列問題:(1)從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA,通過(guò)獲得用于PCR擴(kuò)增。

(2)設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2),為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒,在引物中需要增加適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成,而造成引物自連。

(3)圖中步驟1代表,步驟2代表退火,步驟3代表延伸,這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。

(4)PCR擴(kuò)增時(shí),退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破壞的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān),長(zhǎng)度相同但的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

(5)如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物,則可以采取的改進(jìn)措施有(填標(biāo)號(hào):①升高退火溫度②降低退火溫度③重新設(shè)計(jì)引物)。

3.(2019·江蘇卷)下圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖,載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請(qǐng)回答下列問題:圖1(1)EcoRⅤ酶切位點(diǎn)為,EcoRⅤ酶切出來(lái)的線性載體P1為末端。

(2)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段,其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理,在兩端各添加了一個(gè)堿基為的脫氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在酶作用下,形成重組質(zhì)粒P3。

(3)為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選,得到A、B、C三類菌落,其生長(zhǎng)情況如下表(“+”代表生長(zhǎng),“-”代表不生長(zhǎng))。根據(jù)表中結(jié)果判斷,應(yīng)選擇的菌落是(填表中字母)類,另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是、。

平板類型菌落類型ABC無(wú)抗生素+++氨芐青霉素++-四環(huán)素+--氨芐青霉素+四環(huán)素+--(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒,擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置,PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段,原因是。

圖24.(2016·江蘇卷)下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn),圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn),其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問題:限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ識(shí)別序列及切割位點(diǎn)↓GGATCCCCTAGG↑↓TGATCAACTAGT↑↓GATCCTAG↑↓AAGCTTTTCGAA↑圖1圖2(1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,應(yīng)選用兩種限制酶切割,酶切后的載體和目的基因片段,通過(guò)酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒,需將其轉(zhuǎn)入處于態(tài)的大腸桿菌。

(2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌,應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加,平板上長(zhǎng)出的菌落,常用PCR鑒定,所用的引物組成為圖2中。

(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接,連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為,對(duì)于該部位,這兩種酶(選填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。

(4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒,最多可能獲得種大小不同的DNA片段。

5.(2019·江蘇卷)下列生物技術(shù)操作對(duì)遺傳物質(zhì)的改造,不會(huì)遺傳給子代的是 ()A.將胰島素基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,篩選獲得基因工程菌B.將花青素代謝基因?qū)胫参矬w細(xì)胞,經(jīng)組培獲得花色變異植株C.將腸乳糖酶基因?qū)肽膛Ｊ芫?培育出產(chǎn)低乳糖牛乳的奶牛D.將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞后回輸患者,進(jìn)行基因治療6.(2020·江蘇卷)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列,具體流程如下圖所示(以EcoRⅠ酶切為例)。請(qǐng)據(jù)圖回答問題:(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種酶,它通過(guò)識(shí)別特定的切割特定位點(diǎn)。

(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'-羥基與5'-磷酸間形成;PCR循環(huán)中,升溫到95℃是為了獲得;TaqDNA聚合酶的作用是催化。

(3)若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物,步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是(從引物①②③④中選擇,填編號(hào))。

DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5'—AACTATGCGCTCATGA—3'②5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'③5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'④5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'(4)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序,經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列),結(jié)果正確的是。

A.5'—AACTATGCG-------AGCCCTT—3'B.5'—AATTCCATG-------CTGAATT—3'C.5'—GCAATGCGT-------TCGGGAA—3'D.5'—TTGATACGC-------CGAGTAC—3'7.(2018·江蘇卷節(jié)選)為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶,研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α-淀粉酶基因(1656個(gè)堿基對(duì)),利用基因工程大量制備α-淀粉酶,實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問題:(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α-淀粉酶基因前,需先獲得細(xì)菌的。

(2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接,需在引物的端加上限制性酶切位點(diǎn),且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn),主要目的是。

(3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定,下列選項(xiàng)中的設(shè)定與引物有關(guān),的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。(填標(biāo)號(hào))

①變性溫度②退火溫度③延伸溫度④變性時(shí)間⑤退火時(shí)間⑥延伸時(shí)間(4)獲得工程菌表達(dá)的α-淀粉酶后,為探究影響酶活性的因素,以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性,結(jié)果如下:緩沖液pH酶相對(duì)活性/%50mmol·L-1Na2HPO4-KH2PO46.025.46.540.27.049.87.563.250mmol·L-1Tris-HCl7.570.18.095.58.599.59.085.350mmol·L-1Gly-NaOH9.068.19.563.710.041.510.520.8根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為。

能力1基因工程的操作工具和程序1.限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶和解旋酶的比較種類限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脫氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對(duì)間的氫鍵作用特點(diǎn)切割目的基因及載體,能專一性識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái),恢復(fù)被限制酶切開了的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵只能將單個(gè)脫氧核苷酸添加到已有的核苷酸鏈上,形成新的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈之間的氫鍵打開作用結(jié)果形成黏性末端或平末端形成重組DNA分子形成新的DNA分子形成單鏈DNA分子2.限制酶的選擇方法(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇PstⅠ、EcoRⅠ。②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶,如圖甲不能選擇SmaⅠ。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致(1種或2種限制酶),以確保產(chǎn)生相同的末端;如果是2種限制酶則是保證目的基因的正向連接。②質(zhì)粒作為載體必須具備啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)等,所以選擇的限制酶一定不能破壞啟動(dòng)子、終止子和復(fù)制原點(diǎn),當(dāng)質(zhì)粒具有2個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因時(shí),一定要根據(jù)信息確定不能破壞的標(biāo)記基因,必須保證重組的質(zhì)粒至少有一個(gè)標(biāo)記基因。如圖乙中限制酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因;如果所選限制酶的切割位點(diǎn)不止一個(gè),則切割重組后可能丟失某些片段,若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū),則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制。(3)一般情況下,用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的片段,但有時(shí)可用兩種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因,這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的自身連接,且確保目的基因與載體的正向連接。3.基因工程中載體必須具備的條件條件目的穩(wěn)定并能復(fù)制目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)大有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)可攜帶多個(gè)或多種外源基因具有特殊的標(biāo)記基因便于重組DNA的鑒定和選擇4.基因工程操作程序中的注意點(diǎn)(1)從基因文庫(kù)中獲取目的基因包括從基因組文庫(kù)中獲取和從cDNA文庫(kù)中獲取,cDNA文庫(kù)可以反轉(zhuǎn)錄合成后再利用PCR技術(shù)擴(kuò)增。(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程中最核心的一步,在體外進(jìn)行。(3)基因工程操作過(guò)程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)沒有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象。第一步存在PCR技術(shù)或逆轉(zhuǎn)錄法獲得DNA等,第二步存在黏性末端連接現(xiàn)象,第四步存在核酸分子雜交和PCR等的分子水平檢測(cè)方法。(4)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的,基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控,所以目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間。當(dāng)需要目的基因在特定細(xì)胞中表達(dá)時(shí),需要換成特定的啟動(dòng)子,如目的基因要在乳腺細(xì)胞中表達(dá)時(shí),啟動(dòng)子要換成乳蛋白基因的啟動(dòng)子。(5)植物細(xì)胞的全能性較高,可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過(guò)程成為完整植物體,因此植物基因工程的受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞;高度分化的動(dòng)物細(xì)胞的全能性受到限制,動(dòng)物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物,如酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌)等。(6)基因表達(dá)載體中,啟動(dòng)子(DNA上基因的首端,RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位)不等于起始密碼子(在mRNA上);終止子(DNA上基因的尾端,使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止)不等于終止密碼子(在mRNA上)。(7)個(gè)體水平上的檢測(cè)和鑒定是最簡(jiǎn)單、最有效的方法。能力2PCR技術(shù)1.原理:利用DNA雙鏈復(fù)制的原理,在體外將基因的核苷酸序列不斷地加以復(fù)制,使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。2.條件條件作用緩沖液提供相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境4種dNTP(脫氧核苷酸三磷酸)作為合成DNA子鏈的原料,同時(shí)提供能量DNA作為DNA復(fù)制的模板熱穩(wěn)定DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化合成DNA子鏈(耐高溫)引物使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始延伸DNA鏈3.過(guò)程變性90-95℃,使DNA片段雙鏈解開復(fù)性55-60℃,使解鏈的兩條DNA單鏈分別與相應(yīng)的引物結(jié)合(退火)延伸70-75℃,TaqDNA聚合酶催化子鏈合成4.相關(guān)數(shù)據(jù)項(xiàng)目n輪循環(huán)DNA分子數(shù)2n含引物A(或B)的DNA分子數(shù)2n-1同時(shí)含引物A、B的DNA分子數(shù)2n-2共消耗的引物數(shù)量2n＋1－2兩端等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)2n-2n?深度指津(1)PCR技術(shù)中,不需解旋酶,需耐高溫的DNA聚合酶。(2)關(guān)于引物:依據(jù)目的基因兩端的部分核苷酸序列設(shè)計(jì)。兩種引物之間以及每種引物內(nèi)部不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。復(fù)制n次,需每種引物的數(shù)量是2n-1個(gè)。有時(shí)候引物5'端需要含有某種限制酶的識(shí)別序列。(3)第3次循環(huán)后,才會(huì)出現(xiàn)兩端等長(zhǎng)的目的基因片段?？枷?基因工程的基本操作工具和程序1(多選)科學(xué)家對(duì)紅細(xì)胞膜上的一種蛋白質(zhì)(CHIP28)進(jìn)行測(cè)序并克隆到該蛋白的cDNA,并且將含有CHIP28表達(dá)質(zhì)粒的非洲爪蟾卵細(xì)胞放到低滲溶液中后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞迅速發(fā)生膨脹,而沒有CHIP28表達(dá)質(zhì)粒的卵細(xì)胞形狀沒有變化。此外,他們還將CHIP28重組到脂質(zhì)體上,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該脂質(zhì)體也能吸水膨脹。有關(guān)敘述正確的是 ()A.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要使用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶B.構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的目的是使CHIP28基因能夠在卵細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)C.可以利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將CHIP28表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入非洲爪蟾卵細(xì)胞D.結(jié)果表明CHIP28參與細(xì)胞膜上水分子運(yùn)輸,該方式屬于協(xié)助擴(kuò)散2科研人員利用大腸桿菌構(gòu)建了抗蟲基因文庫(kù)。最新研究發(fā)現(xiàn)漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有顯著的殺蟲效果,現(xiàn)以p-B質(zhì)粒為載體,構(gòu)建AH基因的cDNA文庫(kù)。圖1表示p-B質(zhì)粒,其中Cmlr表示氯霉素抗性基因,ccdB基因表達(dá)產(chǎn)物能抑制大腸桿菌DNA復(fù)制。圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn),且不同種限制酶識(shí)別序列不同,其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別是AG↓CT、T↓CTAGA、AAT↓ATT、C↓AATTG。請(qǐng)分析回答:圖1圖2(1)為獲得AH基因的cDNA,先要從漏斗蜘蛛毒素肽分泌細(xì)胞中提取,再利用反應(yīng)體系中添加,從而準(zhǔn)確合成出AH基因的cDNA,排除其他提取物的干擾。若從漏斗蜘蛛其他組織細(xì)胞提取,則難以成功,原因是其他組織細(xì)胞中。

(2)利用圖中的質(zhì)粒和AH基因構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí),宜選用雙酶切質(zhì)粒,再選用切割目的基因,將切割后獲得的DNA片段混合,經(jīng)DNA連接酶處理后,再與大腸桿菌混合培養(yǎng),在含有適量氯霉素的培養(yǎng)基中添加適量冷的,以促進(jìn)轉(zhuǎn)化。

(3)經(jīng)上述處理培養(yǎng)后,獲得存活的大腸桿菌中應(yīng)含有的質(zhì)粒是,原因。

考向2基因工程的應(yīng)用1下列關(guān)于基因工程的敘述,正確的是 ()A.若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)用到的限制性核酸內(nèi)切酶,則一定有利于該重組質(zhì)粒進(jìn)入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定B.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個(gè)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系,抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入無(wú)關(guān)C.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株,其DNA檢測(cè)均含目的基因,抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達(dá)了抗性蛋白而后者只表達(dá)抗性基因RNAD.已知不同分子量DNA可分開成不同條帶,相同分子量的為一條帶。用某種限制性核酸內(nèi)切酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后,出現(xiàn)3條帶。表明該質(zhì)粒上一定至少有3個(gè)被該酶切開的位置考向3PCR技術(shù)1為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù),研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接,導(dǎo)入楊樹基因組中(如圖)。為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因,同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾,在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),應(yīng)選擇的引物組合是 ()A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④2為增加油菜種子的含油量,研究人員嘗試將酶D基因與位于葉綠體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因相連,導(dǎo)入油菜細(xì)胞并獲得了轉(zhuǎn)基因油菜品種。請(qǐng)回答:圖1圖2(1)構(gòu)建的基因表達(dá)載體中,目的基因酶D基因的上游應(yīng)有,它是酶識(shí)別并結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)酶D基因的轉(zhuǎn)錄。

(2)研究人員依據(jù)基因的已知序列設(shè)計(jì)引物,采用法從陸地棉基因文庫(kù)中獲取酶D基因、從擬南芥基因文庫(kù)中獲取轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因,該技術(shù)所需的工具酶是,所需引物有種,從理論上推測(cè)第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有某種引物(引物A)的DNA片段所占比值為,在第輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。

(3)在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增酶D基因時(shí),使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用陸地棉D(zhuǎn)NA聚合酶的主要原因是

。

(4)酶D基因和轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因所含三種限制酶(ClaⅠ、SacⅠ、XbaⅠ)的切點(diǎn)如圖1所示。則用和酶處理兩個(gè)基因后,可得到端與端(填圖中字母)相連的融合基因。用兩種不同的酶切割目的基因和質(zhì)粒,是為了防止。

(5)將上述融合基因插入圖2所示Ti質(zhì)粒的中,構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)并導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。構(gòu)建的基因表達(dá)載體組成包括啟動(dòng)子、和復(fù)制原點(diǎn)。將獲得的農(nóng)桿菌接種在含的固體平板上培養(yǎng)得到含融合基因的單菌落,再利用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng),可以得到用于轉(zhuǎn)化的侵染液。

(6)剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時(shí)間,此過(guò)程的目的是,進(jìn)一步篩選后獲得轉(zhuǎn)基因油菜細(xì)胞,其中融合基因是整合到油菜細(xì)胞上。(7)用法可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜植株中的融合基因是否成功表達(dá)。

強(qiáng)化訓(xùn)練1.下圖1是限制酶BamHⅠ與BglⅡ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)示意圖,圖2表示質(zhì)粒pZHZ11(總長(zhǎng)為3.8kb,1kb=1000對(duì)堿基)的結(jié)構(gòu),其中,Ap'為鏈霉素抗性基因,lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶,該酶催化生成的化合物能將白色的大腸桿菌染成藍(lán)色。請(qǐng)分析回答問題:圖1圖2(1)圖1表明,酶的作用具有性,利用圖2構(gòu)建成基因表達(dá)載體,還必須加入的組成元件是(2)若先用限制酶BamHⅠ切開pZHZ11,然后滅活BamHⅠ酶,再加酶進(jìn)行連接,最后將連接物導(dǎo)入足夠數(shù)量的大腸桿菌細(xì)胞中,則可使細(xì)胞呈藍(lán)色的質(zhì)粒的最短長(zhǎng)度是。

(3)若將兩端分別用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切開的單個(gè)目的基因片段置換pZHZ11中0.5kb的BamHⅠ酶切片段,形成4.9kb的重組質(zhì)粒,則目的基因長(zhǎng)度為kb。

(4)上述4.9kb的重組質(zhì)粒有兩種形式,若用BamHⅠ和EcoRⅠ聯(lián)合酶切其中一種,只能獲得1.6kb和3.3kb兩種DNA片段;那么聯(lián)合酶切同等長(zhǎng)度的另一種重組質(zhì)粒,則可獲得kb和kb兩種DNA片段。

(5)若pZHZ11上基因表達(dá)時(shí)的堿基序列方向是逆時(shí)針的,為使目的基因定向插入,并獲得在含鏈霉素的培養(yǎng)基上存活且顯白色的大腸桿菌,則切割目的基因編碼區(qū)下游的限制酶應(yīng)為(從題圖涉及的限制酶中選擇)。

2.乳糖不耐癥是由于乳糖酶(LCT)分泌少,不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹瀉。科研工作者利用生物技術(shù)培育出轉(zhuǎn)基因低乳糖奶牛新品種,給患乳糖不耐癥患者帶來(lái)福音。下圖1為轉(zhuǎn)基因低乳糖奶牛培育流程,圖2是使用限制酶BamHⅠ切割DNA產(chǎn)生的結(jié)果。請(qǐng)分析回答問題:圖1…TAGGATCCTCGATC…

…ATCCTAGGAGCTAG……TAGGATCCTCGATC…

…ATCCTAGGAGCTAG…圖2(1)科學(xué)家在構(gòu)建重組質(zhì)粒T時(shí),首先采用PCR技術(shù)對(duì)LCT基因進(jìn)行擴(kuò)增,在擴(kuò)增目的基因的操作過(guò)程中,加入的物質(zhì)有:模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸以及酶;若一個(gè)該DNA分子在PCR儀中經(jīng)過(guò)4次循環(huán),需要個(gè)引物,產(chǎn)物中共有個(gè)等長(zhǎng)的LCT基因片段。

(2)圖1中的牛胎兒成纖維細(xì)胞無(wú)法直接發(fā)育成個(gè)體,需要利用去核卵母細(xì)胞構(gòu)建重組細(xì)胞才能培育出新個(gè)體,其依據(jù)的原理是。

(3)據(jù)圖2分析,BamHⅠ的識(shí)別序列以及切割位點(diǎn)(用“↓”表示)是。

(4)圖1中,切割質(zhì)粒S用的酶是,切割后形成1.8kb和8.2kb(1kb=1000對(duì)堿基)兩種片段。若用BamHⅠ和EcoRⅠ兩種酶切割重組質(zhì)粒T,獲得1.6kb和8.8kb兩種片段,則轉(zhuǎn)入的LCT基因長(zhǎng)度為kb。

(5)在轉(zhuǎn)基因低乳糖奶牛的乳腺細(xì)胞中,可檢測(cè)到的物質(zhì)有(填字母)。

A.LCT基因B.LCTmRNAC.LCT1.3.基因工程為培育抗病毒植物開辟了新途徑,下圖為研究人員培育轉(zhuǎn)花葉病毒外殼蛋白基因(CMV-CP基因,長(zhǎng)度為740個(gè)堿基對(duì))番茄的主要過(guò)程示意圖(Kanr為卡那霉素抗性基因)。請(qǐng)回答:(1)將CMVCP基因?qū)敕鸭?xì)胞后,培育的番茄植株具有抗CMV感染能力,這種現(xiàn)象屬于植物的特異性免疫,該免疫過(guò)程中抗原是。

(2)過(guò)程①接種的農(nóng)桿菌細(xì)胞中,Kanr及CMV-CP基因應(yīng)整合在Ti質(zhì)粒的T-DNA內(nèi)部,這是由于。使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌的目的是(3)為確定用于篩選的Kan適宜濃度,研究人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如下表所示。最終確定過(guò)程③④加入的Kan濃度為35mg·L-1,該濃度既可,又不至于因Kan濃度過(guò)高影響導(dǎo)入重組DNA細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。

Kan濃度/(mg·L-1)接種外植體數(shù)形成愈傷組織數(shù)外植體狀況05549正常形成愈傷組織25662只膨大、不易形成愈傷組織35660變褐色死亡50640變褐色死亡(4)過(guò)程③④所需的培養(yǎng)基為(選填“固體”或“液體”)培養(yǎng)基。過(guò)程⑤再生植株抗性鑒定時(shí),引物序列設(shè)計(jì)的主要依據(jù)是,引物序列長(zhǎng)度及G+C比例直接影響著PCR過(guò)程中(選填“變性”“退火”或“延伸”)的溫度。

(5)過(guò)程⑤電泳結(jié)果如下圖所示,其中1號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)參照,2號(hào)為重組Ti質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物,36號(hào)為抗性植株DNA的PCR產(chǎn)物,可以確定36號(hào)再生植株中號(hào)植株基因組中整合了CMV-CP基因。

4.錦鯉皰疹病毒是一種雙鏈DNA病毒。下圖為TaqMan熒光探針技術(shù)的原理示意圖,探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí)該探針被Taq酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增1個(gè)DNA分子,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。請(qǐng)回答下列問題:(1)在基因工程中,目前獲取目的基因的常用方法除了利用PCR技術(shù)擴(kuò)增外,還有和兩種類型。

(2)引物的化學(xué)本質(zhì)是,其與模板DNA的結(jié)合具有性。

(3)通常情況下,探針中的GC含量比引物中的略高,這有利于保證退火時(shí)與模板DNA結(jié)合。

(4)用TaqMan熒光探針技術(shù)檢測(cè)錦鯉皰疹病毒時(shí),在反應(yīng)體系中要加相應(yīng)的病毒遺傳物質(zhì)、引物、探針和、酶等,其中酶發(fā)揮的具體作用是延伸DNA鏈和。

(5)若最初該反應(yīng)體系中只有一個(gè)病毒DNA分子,經(jīng)n次循環(huán)后,需要消耗TaqMan熒光探針個(gè)。5.PCR是利用體內(nèi)DNA復(fù)制的原理,進(jìn)行生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。請(qǐng)回答有關(guān)問題:(1)PCR反應(yīng)的基本步驟是。

(2)科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶只能催化方向的聚合反應(yīng)。圖1表示細(xì)胞內(nèi)染色體DNA的復(fù)制過(guò)程,有一條子鏈?zhǔn)窍群铣啥痰腄NA片段(稱為岡崎片段),再形成較長(zhǎng)的分子,可推測(cè)參與以上過(guò)程的酶有。在PCR過(guò)程中無(wú)岡崎片