豬瘟活疫苗佐劑稀釋劑的制備及免疫效果評價梁孔賢;呂曉君;丁丹;許琦;周杰;劉衛(wèi)【摘要】本試驗旨在針對性的研發(fā)一種安全性好、能有效增強免疫效果、使用方便的豬瘟活疫苗新型佐劑稀釋劑(AD),并對AD的免疫增強效果進行評價?采用高壓均質技術制備了AD,采用響應面試驗設計優(yōu)化了AD的處方和制備工藝，并對其穩(wěn)定性、粒徑、多分散指數(PDI)及Zeta電位進行表征?將AD與豬瘟活疫苗混合后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,進行佐劑增強免疫效果評價?優(yōu)化處方和工藝制備的AD平均粒徑為100.4nm,PDI為0.147,Zeta電位為-28.7mV,試驗結果表明其穩(wěn)定性良好.免疫效果評價試驗結果顯示，佐劑組小鼠血清中抗豬瘟病毒(CSFV)抗體水平與對照組相比有顯著差異(Pv0.05),抗體水平能持續(xù)較長時間，表明AD能有效誘導機體產生體液免疫應答;佐劑組小鼠血清中IL-4、IL-6和IFN-y的水平均有明顯提高,表明該疫苗佐劑能誘導機體產生細胞免疫應答.本試驗制備的佐劑稀釋劑與疫苗混合使用,能顯著提高體液免疫和細胞免疫水平,從而增強疫苗的免疫刺激能力.期刊名稱】《中國畜牧獸醫(yī)》年(卷),期】2015(042)009【總頁數】7頁(P2467-2473)【關鍵詞】豬瘟活疫苗;佐劑稀釋劑;高壓均質技術;響應面設計【作者】梁孔賢;呂曉君;丁丹;許琦;周杰;劉衛(wèi)【作者單位】華中科技大學生命科學與技術學院,武漢430074;湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,武漢430074;華中科技大學生命科學與技術學院,武漢430074;武漢百思凱瑞納米科技有限公司,武漢430074;湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,武漢430074;華中科技大學生命科學與技術學院,武漢430074;華中科技大學國家納米藥物技術研究中心,武漢430074【正文語種】中文【中圖分類】S859.79佐劑，又被稱作免疫增強劑或免疫調節(jié)劑，是指與疫苗共同使用后能促進或提高機體特異性免疫應答的一類物質［1］。其主要作用是增強機體免疫系統(tǒng)(體液免疫和細胞免疫系統(tǒng))的反應強度和持久性［2］。佐劑被用來增強疫苗免疫作用已有80多年的歷史。故佐劑的研究已成為免疫學領域的重要內容。豬瘟(classicalswinefever,CSF)是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種死亡率極高的急性敗血性、接觸性傳染病，具有流行廣泛、發(fā)病率高等特點，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大［3］。預防豬瘟最有效的方法就是接種豬瘟疫苗。盡管豬瘟兔化弱毒苗的廣泛應用及其他綜合防制措施的實施已控制了豬瘟的大規(guī)模流行，但近年來，豬瘟在亞洲、歐洲、南美洲等地區(qū)呈現(xiàn)復發(fā)的趨勢［4-5］。目前市場上預防豬瘟的疫苗主要有3種：乳兔苗、細胞苗和淋脾苗，這3種均為活疫苗，在臨床使用上有一定的功效，但疫苗的免疫成功率不高，除了疫苗質量、免疫程序、接種部位等因素以外，機體免疫功能低下及免疫刺激不夠是重要因素，某些病原感染導致機體的免疫功能低下或免疫抑制。而且部分疫苗，尤其是一些油佐劑疫苗接種后免疫應激反應很大，使用一些低免疫應激反應佐劑是發(fā)展趨勢［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，免疫增強劑在豬瘟疫苗使用中能提高豬免疫力，對豬瘟疫苗的抗體水平有不同程度的影響［7］?；诖?，本試驗研究制備一種新型豬瘟活疫苗佐劑稀釋劑(AD)，旨在通過添加免疫增強劑，使水包油(O/W)型納米乳疫苗佐劑增強疫苗本身的細胞及體液免疫刺激能力，尤其是該疫苗佐劑還可能同時含有適用于提高豬瘟活疫苗效力的其他水性佐劑成分，進一步提高活疫苗的攻毒保護效力。儀器設備JN-02HC高壓均質機購自廣州聚能生物科技有限公司；MalvernNanoZS90馬爾文激光粒度儀購自英國Malvern公司；FLUKOFA25高剪切分散乳勻機購自上海弗魯克流體機械制造有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器購自河南鞏義英峪予華儀器廠；TGL-20M高速離心機購自長沙平凡儀器有限公司。試驗動物和試劑BALB/c小鼠(18~20g,SPF級)由中國醫(yī)學科學院動物實驗研究所提供。Marcol52醫(yī)用級白油購自廣州俏靈兒生物科技公司；二縮甘露醇單油酸酯(CithrolMMO)購自上海浩鼎貿易有限公司；Tween-80、葡萄糖酸錳、葡萄糖酸鈣、乙二胺四乙酸二鈉鹽(分析純)均購自國藥集團；黃芪多糖(優(yōu)級)購自什邡生物制品有限公司；苯甲酸鈉(分析純)購自沈陽試劑一廠；IDEXXCSFV抗體檢測試劑盒購自北京愛得士元亨生物科技有限公司；小鼠白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)試劑盒及小鼠干擾素y(ifn-y)試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。方法AD的制備①將一定量的葡萄糖酸錳、乙二胺四乙酸二鈉鹽、Tween-80及苯甲酸鈉等水溶性成分置于同一燒杯內，加30mL蒸餾水，磁力攪拌器下分散均勻，作為水相；②將處方量的Marcol52醫(yī)用級白油及MMO置于同一燒杯內，磁力攪拌器分散均勻，作為油相；③在磁力攪拌下將油相慢慢加至水相中，攪拌得穩(wěn)定的乳液，用0.1mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液調節(jié)pH至8.0,用蒸餾水定容至50mL；④室溫條件下，將初乳進行高壓均質，制得O/W型的納米乳劑；⑤將所制得的納米乳劑通過0.22pm的微孔濾膜過濾除菌；⑥將所得納米乳劑充氮灌裝，室溫下放置。即制得AD。1.3.2響應面優(yōu)化設計優(yōu)選處方根據Box-Behnken的中心組合設計原理［8］，以油性佐劑的比例(A)、Tween-80/MMO比值(B)、無機鹽與絡合劑比例(C)為影響因素，以粒徑(size)為考查指標進行L9(33)響應面試驗設計。響應面法試驗方案見表1。AD理化性能用超純水將制備的AD水分散液稀釋300倍，采用激光粒度儀測定其水分散液的粒徑及PDI，測試角度為90°,測試溫度為25°C,重復15次。取其適量水分散液加入U型電泳池中，用0.9%的生理鹽水調節(jié)電導率至50ps/cm以上，測定其Zeta電位，測試溫度為25°C［9］。AD免疫效果的評價將72只體重為18-22g的BALB/c小鼠均分為4組，每組18只。選擇效果最優(yōu)的佐劑,按照表2方案進行免疫,通過體重換算,將10頭份/瓶的豬瘟活疫苗，均分為20份，每份用0.5mLAD或生理鹽水稀釋，免疫途徑均采用肌肉注射免疫,兩周后用同樣劑量進行第2次免疫［10］。分別于免疫后0、1、2、3、4、5、6周,每組隨機抽取3只小鼠斷尾采血,分離血清,56C水浴30min滅活補體。按照檢測試劑盒使用說明書進行操作，通過測定標記酶的D450nm值檢測小鼠IL-4、IL-6、IFN-y及豬瘟病毒抗體水平的變化［11］。響應面優(yōu)化設計篩選處方利用Design-Expert(version7.1.5,Stat-Easelnc)軟件對表1試驗數據進行多元回歸擬合，得到粒徑(size)、油性佐劑的比例(A)、Tween-80/MMO比值(B)、無機鹽與絡合劑比例(C)的二次多項回歸模型為：Size=3.29+0.24A+0.26B+0.11C+0.28AB-0.053AC-9.218BC-0.56A2-0.35B2-0.52C2，對該模型進行方差分析，得出回歸模型系數顯著性檢驗結果(表3)。模型P=0.0005小于0.05，表明回歸模型顯著；復相關系數R=0.9593，說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小,可以此模型來分析和預測粒徑較好的乳劑的處方結果。AdeqPrecision值為11.442，說明模型完全可以用來對試驗結果進行擬合。失擬項的F值為2.07,P值為0.2467，說明失擬項不顯著，擬合度高?；貧w模型系數顯著性檢驗結果可知，該模型一次項A、B極顯著（PvO.01）,通過響應面軟件分析可得到最優(yōu)處方參數：白礦油5%、表面活性劑5%、免疫增強劑1%、穩(wěn)定劑3%、防腐劑0.4%。AD理化性能根據方法1.3.3測定所得的響應面試驗方案各組的粒徑、PDI及Zeta電位，所得結果見表4。采用響應面試驗設計優(yōu)化FAD的處方，并對其穩(wěn)定性、粒徑、多分散指數（PDI）及Zeta電位進行表征。優(yōu)化處方的AD平均粒徑為100.4nm,PDI為0.147,Zeta電位為-28.7mV,試驗表明其穩(wěn)定性良好。免疫效果的評價2.3.1抗體水平的測定分別對每周收集的血清進行ELISA抗體水平的測定，對各組所測數據進行統(tǒng)計分析，得到的抗體消長曲線見圖1。經統(tǒng)計分析表明，免疫前各組之間的抗體水平無明顯差異，免疫后各疫苗組抗體水平都有明顯的升高，免疫后第4周，1組（佐劑+疫苗組）的抗體達到最高水平，且與IV組（生理鹽水組）和其他疫苗組差異明顯，隨后呈下降趨勢，但下降趨勢較其他各組緩慢，抗體水平持續(xù)較長的時間。各疫苗組均在二免后第1~2周達到抗體高峰，從抗體水平的高峰值來看，結果為I組（佐劑+疫苗組）〉口組（生理鹽水+疫苗組）〉皿組（佐劑組）＞IV組（生理鹽水組）。說明佐劑+疫苗能誘導機體產生很好的體液免疫應答。2.3.2細胞因子IL-4、IL-6和IFNj的測定由圖2可知，在首次免疫后第1周，各組IL-4的水平均有所升高，第2次免疫后第1~2周，各組IL-4值均不同程度的達到峰值,1（佐劑+疫苗組）、口（生理鹽水+疫苗組）組與V組（生理鹽水組）差異明顯，其中I組（佐劑+疫苗組）在達到峰值后，呈緩慢下降，趨于平緩的趨勢，而口組（生理鹽水+疫苗組）在達到峰值后，下降趨勢較大，說明佐劑+疫苗能顯著增強IL-4水平。由圖3可知，在首次免疫后第1周，各組IL-6均有所升高，第2次免疫后，各組IL-6值均不同程度增強,1（佐劑+疫苗組）、口（生理鹽水+疫苗組）組與IV組（生理鹽水組）差異明顯，其中口組（生理鹽水+疫苗組）在達到峰值后，有下降趨勢，而I組（佐劑+疫苗組）和皿組（佐劑組）在逐步增強，繼而達到峰值。證明佐劑+疫苗能產生較強的細胞免疫應答。由圖4可知，在首次免疫后，各組IFN-y均有所升高，第2次免疫后，各組IFN-Y值均不同程度增加，其他3組與V組（生理鹽水組）差異顯著，各組均逐步增加到最后達到峰值。其中I組（佐劑+疫苗組）的增加程度明顯高于口組（佐劑組）和皿組（生理鹽水+疫苗組）。說明佐劑+疫苗能產生較強的細胞免疫應答。豬瘟活疫苗疫苗佐劑要求安全、有效，無明顯的毒副作用，可顯著增強疫苗的細胞及體液免疫刺激能力，提高活疫苗和滅活疫苗的攻毒保護效力，增強疫苗的作用效果，提高機體自身的免疫力［12］。O/W孚L劑型疫苗佐劑具有流動性好，易于注射，可減少油相的副作用等優(yōu)點［13］。本試驗采用高壓均質技術制備新型O/W乳劑型豬瘟活疫苗佐劑，通過添加適用于提高豬瘟活疫苗效力的免疫增強劑，增強疫苗的細胞及體液免疫刺激能力［14］。使用Span80作為親油性表面活性劑常有報道，本試驗中使用具有免疫增強作用的親油性表面活性劑MMO,所制備的佐劑免疫刺激效果好。為防止乳劑的酸敗，需要加入防腐劑。由于防腐劑尼泊金類與Tween類發(fā)生反應生成絡合物后會降低尼泊金類的抑菌能力，最終選用防發(fā)酵能力強的苯甲酸鈉作為防腐劑［15］。應用超聲法制備乳劑，乳滴粒徑分布較均勻，但粒徑偏大，乳劑不穩(wěn)定，高速剪切法可同時產生剪切力和擊碎力，粒徑細小，乳化效果好，但應注意剪切時的氣泡現(xiàn)象，在整個制備過程中充氮氣保護［16］。高壓均質過程中，為防止溫度過高影響制劑的穩(wěn)定性，應用制冷系統(tǒng)同步降溫，本試驗溫度為25°C,以保證制劑的穩(wěn)定性。通過響應面試驗設計優(yōu)化處方和工藝條件制備的O/W型疫苗佐劑平均粒徑為100.4nm,PDI為0.147,Zeta電位為-28.7mV,與傳統(tǒng)的佐劑相比穩(wěn)定性良好。本試驗采用間接ELISA方法，測定了將疫苗佐劑和豬瘟活疫苗混合肌肉注射免疫小鼠后小鼠血清抗體的變化，通過比較不同試驗組產生抗體水平的差異，結果顯示在免疫前各組之間的小鼠血清中抗豬瘟病毒抗體水平無明顯的差異，免疫后佐劑+疫苗組抗體效價上升較快，隨后呈緩慢下降趨勢，并且與文獻［17］報道的疫苗佐劑相比，抗體水平持續(xù)時間較長，表明O/W乳劑型豬瘟活疫苗佐劑能有效誘導機體產生體液免疫應答；試驗結果表明制備的AD和疫苗相互作用均能誘導機體的IL-4的分泌表達，并與其余各組差異顯著，說明該AD和疫苗混合組能顯著誘導Th2型細胞產生免疫應答反應，誘導其分泌IL-4，從而增強B細胞的活性，提高抗體產生的滴度，這與小鼠血清中豬瘟病毒抗體水平的檢測結果相一致，說明該AD和疫苗混合組也能產生較強的體液免疫應答；制備的AD和疫苗相互作用能誘導IL-6、IFN-y的分泌表達，說明該組疫苗能顯著增強Th1型細胞產生免疫應答反應，誘導其分泌IFN-y，從而增強細胞免疫水平，說明該AD和疫苗相互作用能產生較強的細胞免疫應答［18］。說明O/W乳劑型豬瘟活疫苗佐劑能有效誘導機體產生體液免疫應答和細胞免疫應答，從而增強疫苗免疫刺激的能力。本試驗研制的新型O/W疫苗AD，能明顯的輔助增強豬瘟活疫苗的免疫刺激能力，穩(wěn)定性好，制備簡便，易于向大規(guī)?；a推廣。*通信作者：劉衛(wèi)(1966-)，男，湖北武漢人，教授，博士生導師，主要從事納米載藥系統(tǒng)、現(xiàn)代制劑技術等研究，Tel:************/68789309 ;E-mail:*************.cn【相關文獻】［1］ 國家藥典委員會?中華人民共和國藥典(一部)［S］?北京：化學工業(yè)出版社，2000.［2］ 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