南昌市hivaids患者人芽囊原蟲感染狀況及基因型分析

1911年，艾莉埃首次發(fā)現(xiàn)并廣泛寄生在人類和其他靈長類動物身上，包括母乳、跳躍和鳥類和其他昆蟲指標(biāo)。人芽囊原蟲既可存在于有癥狀感染者中，也可存在于無癥狀攜帶者中，因此其致病性一直存在爭議1試驗(yàn)對象和方法1.1hiv陽性患者的管理調(diào)查對象為南昌市的HIV/AIDS患者，對象來源為南昌市縣區(qū)疾控中心的美沙酮門診、南昌市傳染病醫(yī)院和南昌市轄區(qū)各監(jiān)獄醫(yī)院在冊管理的HIV陽性患者。準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)為愿意參加研究的所有HIV/AIDS患者。1.2方法1.2.1調(diào)查問卷及調(diào)查2016年5—9月，由當(dāng)?shù)馗餍l(wèi)生機(jī)構(gòu)（包括縣區(qū)疾控美沙酮門診、南昌市傳染病醫(yī)院、監(jiān)獄醫(yī)院）宣傳動員，調(diào)查員均為當(dāng)?shù)匦l(wèi)生機(jī)構(gòu)的艾滋病防治工作人員。對調(diào)查對象進(jìn)行編號、問卷調(diào)查，對符合條件的HIV/AIDS患者采集糞樣（大于3g或3ml）和血樣（1ml）。糞樣送南昌市疾病預(yù)防控制中心寄生蟲實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鏡檢和培養(yǎng)，剩余樣品置-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?.2.2血液樣本的檢測血樣送南昌市疾病預(yù)防控制中心和南昌市傳染病醫(yī)院，采用流式細(xì)胞儀檢測CD41.2.3糞樣人芽囊原蟲dna基因組的提取采用基因組DNA提取試劑盒[購自天根生化科技（北京）有限公司]提取HIV/AIDS患者糞便人芽囊原蟲DNA基因組，每份樣品裝兩管，每管25μlDNA模板，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.4擴(kuò)增引物及擴(kuò)增采用PCR方法擴(kuò)增目的基因，目的基因?yàn)閬碜匀搜磕以x小亞基核糖體核糖核酸（SSUrDNA）的長度約為570bp序列片段，擴(kuò)增引物為F:5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′，R:5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1μl，樣品DNA1μl,PCR混合液12.5μl，加ddH1.2.5測序及測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，對陽性產(chǎn)物送公司進(jìn)行雙向基因測序，基因測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測序結(jié)果通過BLAST軟件在NCBI上與GenBank數(shù)據(jù)庫參考序列進(jìn)行比對，并使用MEGA6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行基因亞型的分型。1.3問卷的錄入與核查采用Epidata3.1軟件建立調(diào)查問卷數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行雙人錄入并核查。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS21.0軟件分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩樣本率的比較采用χ1.4倫理批準(zhǔn)和知情同意本研究獲得中國疾病與控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號為2014-004），涉及的問卷調(diào)查與血樣、糞樣采集等，均取得所有調(diào)查者本人或家屬的知情同意。2結(jié)果2.1受教育程度描述共調(diào)查HIV/AIDS對象505人，其中男性427人（84.55%），女性78人（15.45%），年齡最小的17歲，最大的86歲，平均年齡為（40.2±14.3）歲。漢族475人（94.26%），彝族20人（3.96%）（其中17人為監(jiān)獄在押或者服刑人員），維吾爾族8人（1.58%），壯族和回族各1人（0.20%）。受教育程度初中及以下有340人（67.33%）。通過性傳播、注射器感染和血液感染HIV的人數(shù)分別為402人（79.60%）、57人（11.29%）和5人（1.00%),41人（8.12%）不知道其感染途徑。來源于南昌市各縣區(qū)疾控中心美沙酮門診、南昌市傳染病醫(yī)院和南昌市轄區(qū)各監(jiān)獄醫(yī)院的調(diào)查對象人數(shù)分別為107人（21.19%）、308人（60.99%）和90人（17.82%）。2.2hiv/aids患者的感染情況505份HIV/AIDS患者糞樣中人芽囊原蟲PCR檢測結(jié)果陽性21份。其中HIV/AIDS男性檢測427人，人芽囊原蟲感染者18例；HIV/AIDS女性檢測78人，人芽囊原蟲感染陽性者3例，不同性別感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ南昌市各縣區(qū)疾控中心美沙酮門診、南昌市傳染病醫(yī)院和南昌市轄區(qū)各監(jiān)獄醫(yī)院的HIV/AIDS患者人芽囊原蟲的感染率分別為3.74%(4/107）、1.62%(5/308）和13.33%(12/90）。南昌市轄區(qū)監(jiān)獄來源的HIV/AIDS患者人芽囊原蟲的感染率高于市各縣區(qū)疾控中心美沙酮門診（χ475例HIV/AIDS患者檢測了CD4調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，HIV/AIDS患者中近3個月內(nèi)有腹痛、腹瀉等癥狀的占7.92%(40/505），其中人芽囊原蟲PCR檢測結(jié)果陽性者近3個月內(nèi)有腹痛、腹瀉等癥狀占19.05%(4/21）。人芽囊原蟲PCR檢測結(jié)果陽性者近3個月內(nèi)有腹痛、腹瀉等癥狀的比例與人芽囊原蟲PCR檢測結(jié)果陰性者無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2.3人芽囊原蟲遺傳進(jìn)化分析研究共獲得人芽囊原蟲陽性序列21條（其中20條為570bp,1條為260bp），基因亞型分型結(jié)果為：ST3亞型19條，占全部人芽囊原蟲陽性序列數(shù)的90.48%；其他亞型為ST1、ST7，均占4.76%(1/21）。將本研究中20株人芽囊原蟲分離株（NC1013、NC1018、NC1019、NC1045、NC1046、NC1049、NC1054、NC1085、NC1086、NC1087、NC1095、NC1100、NC1121、NC1136、NC1139、NC1373、NC1442、NC1454、NC1499、NC1510）與近年來國內(nèi)的分離株以及從GenBank上下載的國際代表株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示：南昌市18株人芽囊原蟲ST3亞型分離株與云南開遠(yuǎn)分離株Kaiyuan-1(GenBank登錄號KY019162.1）、Kaiyuan-2(GenBank登錄號KY019163.1）、Kaiyuan-3(GenBank登錄號KY019164.1）和上海市分離株Shanghai-1(GenBank登錄號KY019166.1）、Shanghai-3(GenBank登錄號KY019167.1）處于同一分支，均為ST3亞型。NC1100分別與法國分離株ST1-FJ666843-France(GenBank登錄號FJ666843.1）、ST1-FJ666884-France(GenBank登錄號FJ666884.1）親緣關(guān)系最為密切；NC1454則與日本分離株ST6-AB091242-Japan(GenBank登錄號AB091242.1）、ST6-AB070995-Japan(GenBank登錄號AB070995.1）關(guān)系更為緊密。NC1013分離株非常接近日本ST7亞型分離株ST7-AB091244-Japan(GenBank登錄號AB091244.1）、ST7-AB091239-Japan(GenBank登錄號AB091239.1）（圖1）。3監(jiān)獄hiv/aids患者傳播途徑的研究目前一般認(rèn)為，人芽囊原蟲感染是人類腹瀉的重要原因之一，機(jī)體營養(yǎng)不良和免疫功能缺陷或低下者，更易受到人芽囊原蟲的感染本研究發(fā)現(xiàn)，市轄區(qū)監(jiān)獄來源的HIV/AIDS患者的感染率明顯高于其他兩個來源醫(yī)療機(jī)構(gòu)，因?yàn)楸O(jiān)獄HIV/AIDS患者的特殊性，監(jiān)獄管理機(jī)構(gòu)一般為監(jiān)獄HIV/AIDS患者設(shè)立單獨(dú)的監(jiān)區(qū)，HIV/AIDS患者的共同生活可能存在人芽囊原蟲宿主甚至人芽囊原蟲的相互傳播，本課題組將在下一步對