基于超速離心法的mxex小鼠肝癌細(xì)胞來源外泌體抗腫瘤研究

肝腫瘤是影響人類生活和健康的疾病之一。肝癌的發(fā)病率為世界排名第三，發(fā)病率也達(dá)到世界第六。外泌體（exosome）作為一種直徑在100nm左右的生物納米囊泡1材料和方法1.1免疫組化抗體小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6來自C57/BL6(H-2b），購(gòu)買于中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司。MTX（美國(guó)，Sigma公司）、PKH67熒光染料（美國(guó)，Sigma公司）、兔源CD63多克隆抗體（美國(guó)，SantaCruz公司）、羊源Alix多克隆抗體（美國(guó)，SantaCruz公司）、兔源CytochromeC單克隆抗體（美國(guó)，CST公司）、HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（美國(guó)，Sigma公司）、HRP標(biāo)記的兔抗羊抗體（美國(guó)，Sigma公司）。清潔級(jí)6～8周的C57BL/6健康雄鼠50只，體重在18～20g，購(gòu)于南京模式動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：201700764，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0001。1.2方法1.2.1texomo細(xì)胞培養(yǎng)選用小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6作為腫瘤外泌體（tumorexosome，以下簡(jiǎn)稱TEX）的來源細(xì)胞，培養(yǎng)基為10%胎牛血清（去除血清自身含有的外泌體）的DMEM。在肝癌細(xì)胞中加入100μg/mL的MTX，將培養(yǎng)皿置于紫外線下（UBV,300Jm1.2.2醋酸鈾染色及pcr染色將超速離心得到的10μL外泌體懸液加入到等體積的4%多聚甲醛溶液中冰上固定20min；吸取固定好的外泌體滴到銅網(wǎng)上，室溫放置20min；吸去多余的溶液，向銅網(wǎng)滴加50μL1%戊二醛溶液，室溫孵育5min；吸去戊二醛溶液，滴加100μL去離子水洗滌銅網(wǎng)，每次洗2min，洗8次；向銅網(wǎng)滴加50μL草酸鈾溶液負(fù)染5min；吸去多余溶液，向銅網(wǎng)上滴加50μL甲基纖維素-乙酸雙氧鈾溶液，置于冰上染色10min；吸去多余的溶液，置于濾紙上晾干銅網(wǎng)，透射電鏡觀察。1.2.3免疫免疫scdf體取一個(gè)鋪滿10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿的肝癌細(xì)胞，消化、洗滌、離心得到腫瘤細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取肝癌細(xì)胞總蛋白。按30μg上樣，進(jìn)行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜，分別孵育一抗鼠源CD63單克隆抗體、一抗鼠源Alix單克隆抗體和一抗兔源CytochromeC單克隆抗體，4℃孵育過夜。次日，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶洗滌PVDF膜3次，每次洗滌10min；加入二抗，4℃搖床孵育2h;PBST洗滌3次，每次10min；最后滴上發(fā)光液，壓片曝光。小鼠腹股溝皮下接種5×101.2.5肝腫瘤模式與皮下腫瘤的形成及系統(tǒng)治療將Hepa1-6細(xì)胞消化、洗滌、計(jì)數(shù)，每只小鼠皮下腹股溝接種5×101.2.6伊紅染液的制備使用自動(dòng)石蠟切片機(jī)將不同治療組小鼠心臟、肝臟、腎臟、腫瘤石蠟組織塊切成厚度約7mm石蠟片，并黏附于新的載玻片上，將載玻片置于65℃烘箱中烘烤1.5h，二甲苯進(jìn)行脫蠟45min，按體積分?jǐn)?shù)從高到低進(jìn)行酒精梯度水化，每個(gè)梯度浸泡5min；使用蘇木紅染液對(duì)切片進(jìn)行染色13min，蒸餾水中進(jìn)行反藍(lán)；再用伊紅染液對(duì)組織細(xì)胞質(zhì)染色30s，使用蒸餾水洗去未結(jié)合的伊紅染液；按體積分?jǐn)?shù)從低到高依次進(jìn)行酒精梯度脫水，二甲苯浸泡13min繼續(xù)脫水，使其透明；中性樹膠封片，風(fēng)干后置于正置顯微鏡下觀察拍照。1.3統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)使用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用2結(jié)果2.1mtx負(fù)載對(duì)cd3蛋白表達(dá)的影響Western印跡檢測(cè)外泌體特征蛋白CD63的表達(dá)，結(jié)果顯示，MTX的負(fù)載并不影響外泌體中CD63蛋白表達(dá)豐度（圖1A）。進(jìn)一步利用透射電鏡檢測(cè)TEX和TEX2.2mtx的保留時(shí)間及外泌體的濃度采用HPLC測(cè)定外泌體中MTX的藥物濃度，結(jié)果顯示：MTX的保留時(shí)間約為4.12min（圖2A），外泌體中MTX濃度為0.5μg/μL（圖2B）。2.3肝腫瘤活性物質(zhì)的tox為了驗(yàn)證肝癌靶向肽SP94修飾的TEX2.4sp94-sp05-tex為了進(jìn)一步研究外泌體錨定肽結(jié)合肝癌靶向肽SP94修飾的TEX2.5sp94-sp05-tex為了進(jìn)一步評(píng)估SP94-CP05-TEX3化療藥物為化療藥物治療目前，化療是肝癌的主要治療手段之一，雖然化療藥物種類多，抑癌效果良好，但是由于化療藥物難以精準(zhǔn)遞送到腫瘤部位，增加了用藥劑量的同時(shí)也給全身帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且長(zhǎng)期給藥導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受并破壞自身免疫系統(tǒng)，降低了治療效果本研究通過紫外線照射MTX處理的小鼠肝癌細(xì)胞成功獲得高效負(fù)載MTX的外泌體TEX綜上所述，本研究通過體外、體內(nèi)研究，證實(shí)了肝癌靶向肽修飾的外泌體，可將負(fù)載的甲氨蝶呤精準(zhǔn)遞送到腫瘤組織，有效抑制肝癌生長(zhǎng)，并且改善了化療藥物引發(fā)的不良反應(yīng)，為肝癌的化學(xué)藥物治療提供了新的思路和策略。同時(shí)為了更好的模擬肝癌的發(fā)生和復(fù)雜的免疫微環(huán)境，后續(xù)研究中，筆者將在小鼠原位或原發(fā)肝癌模型中，進(jìn)一步驗(yàn)證肝癌靶向肽修飾的負(fù)