人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)

干預(yù)是存在于胚胎或成體組織中、自我更新、復(fù)制和多向分化能力的非分化細(xì)胞。材料和方法1體外消化對(duì)第5代細(xì)胞的體外消化hUC-MSCs(武漢漢密頓生物科技股份有限公司,批號(hào):UC0005M201W01),為原代細(xì)胞體外經(jīng)胰酶消化5次所得的第5代細(xì)胞,保存于液氮中,臨用前使其懸浮于裝有100mL生理鹽水的特定密封輸液袋中,臨床擬用劑量為1～2×102股份有限公司AX1502ZH/E電子天平(美國(guó)Ohaus公司);XK8101電子秤(美國(guó)Ohaus公司);Klite8G多參數(shù)電解質(zhì)分析儀(梅州康利高科技有限公司);H800干化學(xué)尿液分析儀(迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司);ACLTOP300CTS全自動(dòng)凝血分析儀(沃芬公司);XN1000IV全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀、BX3010全自動(dòng)生化分析儀(日本Sysmex公司);SPX150BZ生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);ASP300S全自動(dòng)脫水儀(德國(guó)Leica公司);RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);MBⅡ全自動(dòng)包埋儀(武漢賽爾思科技有限公司);BX53生物顯微鏡(日本Olympus公司);DT101A電子體溫計(jì)(廣東天際電器有限公司);TDZ5WS低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司);ECG1103GVET動(dòng)物心電圖機(jī)(深圳市凱沃爾電子有限公司)。3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及小鼠普通級(jí)家兔1只,雄性,體重3.0kg,武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2016-0011;SPF級(jí)KM小鼠10只,雌雄各半,體重18～22g,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002;普通級(jí)Hartley豚鼠28只,雌雄各半,體重300～400g,武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2016-0011;SPF級(jí)BALB/c-nu小鼠(裸鼠)30只,雌性,體重14～17g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011;SPF級(jí)KM小鼠40只,雌雄各半,體重18～22g,武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2012-0013;普通級(jí)食蟹猴,雌雄各半,體重2.5～3.5kg,廣州悅源動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2015-0038。4家庭母性溶血試驗(yàn)家兔心臟采血,經(jīng)脫纖處理后分別加入0.5,0.4,0.3,0.2和0.1mL的hUC-MSCs,濃度1×105鹽水對(duì)照組10只小鼠分成hUC-MSCs組和生理鹽水對(duì)照組,每組5只。hUC-MSCs組每只小鼠腹腔一次性緩慢注射供試品0.5mL,濃度1×106大鼠的自動(dòng)過敏測(cè)試24只豚鼠按體重隨機(jī)分為4組,每組6只,雌雄各半。低劑量組致敏劑量為每只豚鼠5×107各組小鼠血清中hela細(xì)胞陽(yáng)性檢測(cè)30只裸鼠按體重隨機(jī)分為hUC-MSCs組、生理鹽水陰性對(duì)照組和Hela細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組,每組10只。將hUC-MSCs,Hela細(xì)胞重懸于生理鹽水中,分別配成5×108單次給藥毒性試驗(yàn)40只KM小鼠按體重隨機(jī)分為hUC-MSCs低劑量組(2×109單次給藥毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明,最大劑量下10.0×1010處理數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以結(jié)果1溶血及凝聚測(cè)定在3h內(nèi)hUC-MSCs各管和生理鹽水陰性對(duì)照管均未發(fā)生溶血和凝聚現(xiàn)象,超純水陽(yáng)性對(duì)照管有溶血現(xiàn)象發(fā)生。結(jié)果表明,hUC-MSCs對(duì)家兔無(wú)體外溶血和致紅細(xì)胞凝聚作用。2部分正常,國(guó)家不穩(wěn)定給藥當(dāng)日和觀察期間各組小鼠、豚鼠均未出現(xiàn)死亡,毛色、眼睛、呼吸、分泌物、排泄物、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)均正常。結(jié)果表明,hUC-MSCs對(duì)小鼠、豚鼠無(wú)異常毒性。3小鼠卵清白蛋白陽(yáng)性對(duì)照激發(fā)后典型異常反應(yīng)d14和d212次激發(fā)過程中,hUC-MSCs劑量組和生理鹽水陰性對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)后均未見過敏反應(yīng),卵清白蛋白陽(yáng)性對(duì)照組所有動(dòng)物均出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、呼吸困難、痙攣等明顯的過敏癥狀,并于給藥后3min內(nèi)死亡。結(jié)果表明,hUC-MSCs的主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)為陰性。4小鼠骨髓組織病理學(xué)檢查是否出現(xiàn)節(jié)Hela細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組所有動(dòng)物從給藥后d3注射部位均出現(xiàn)結(jié)節(jié),3個(gè)月觀察期內(nèi)結(jié)節(jié)未消失;hUC-MSCs組6/10例動(dòng)物從給藥后d3注射部位出現(xiàn)結(jié)節(jié),給藥后d5～d7陸續(xù)消失,此后的觀察期內(nèi)也未見結(jié)節(jié)出現(xiàn);生理鹽水陰性對(duì)照組所有動(dòng)物給藥后到觀察期結(jié)束,均未出現(xiàn)結(jié)節(jié)。觀察1個(gè)月和3個(gè)月結(jié)束,各組處死5只動(dòng)物,肉眼觀察發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs組和生理鹽水陰性對(duì)照組所有動(dòng)物注射部位均未見結(jié)節(jié)形成,各淋巴結(jié)及組織器官均未見明顯異常。Hela細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組所有動(dòng)物注射部位均出現(xiàn)2.2mm×1.3mm～10mm×7mm不同大小白色質(zhì)硬結(jié)節(jié)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),hUC-MSCs組和生理鹽水陰性對(duì)照組所有動(dòng)物給藥局部未見腫瘤形成;Hela細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組所有動(dòng)物給藥局部形成腫瘤,且2個(gè)階段各有1只動(dòng)物肌層或周圍結(jié)締組織侵及或可見轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞,但未見淋巴結(jié)及其他器官的轉(zhuǎn)移(見圖1)。5對(duì)死亡動(dòng)物的影響給藥當(dāng)日,高劑量組4只動(dòng)物、中劑量組1只動(dòng)物均在給藥后30min內(nèi)死亡;高、中劑量組其余動(dòng)物均出現(xiàn)呼吸急促、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲緩等癥狀,均在1h內(nèi)恢復(fù)正常;低劑量組在給藥當(dāng)日和23d觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)任何異常情況;給藥后d2,中劑量組死亡1只動(dòng)物。其余23d觀察期內(nèi)未出現(xiàn)動(dòng)物死亡和其他異常情況發(fā)生。給藥后d1和d2高劑量組與溶劑對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.01或P<0.05),體重均低于溶劑對(duì)照組;其他組各階段各組體重與溶媒對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。對(duì)死亡動(dòng)物及觀察期結(jié)束后處死的動(dòng)物進(jìn)行剖檢,肉眼觀察各組織臟器未見大體異常改變。對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,所有動(dòng)物肺臟小血管、毛細(xì)血管均可見微血栓形成;給藥后d2,中劑量組死亡動(dòng)物肺臟小血管、毛細(xì)血管微血栓形成的同時(shí),伴隨肝細(xì)胞輕微變性,結(jié)果見圖2。觀察期結(jié)束后處死的動(dòng)物組織病理學(xué)檢查未見異常。6單次給藥毒性試驗(yàn)給藥當(dāng)日及14d觀察期間內(nèi),4個(gè)劑量組(10.0×10單次給藥安全性實(shí)驗(yàn)單次給藥毒性試驗(yàn)中,10.0×10單次給藥毒性試驗(yàn)中,本研究發(fā)現(xiàn)10.0×10在其他研究方面,hUC-MSCs同樣顯示具有很高的安全性。在體內(nèi)或體外均具有很低的免疫原性,異體輸注后不會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生免疫排斥,主要由于其