流式細(xì)胞儀原理第1頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞術(shù)的原理流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種能對單個(gè)細(xì)胞、分子和生物顆粒（微生物）進(jìn)行多參數(shù)快速檢測的新型分析和分選技術(shù)。近幾年隨著多種單克隆抗體的成功制備和多種熒光素的應(yīng)用。FCM逐步運(yùn)用于對疾病診斷和治療監(jiān)測的臨床檢驗(yàn)常規(guī)工作。第2頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理流路流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個(gè)/ml光路光源檢測信號光電倍增管PMTHV電路放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計(jì)：計(jì)算機(jī)第3頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月流路單細(xì)胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過程,成為流體動力學(xué)聚焦第4頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluid第5頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月光路光源檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側(cè)向角散射光(90度散射光)熒光信號 熒光染料 光學(xué)濾片

顏色補(bǔ)償電路光電倍增管第6頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

光路光源 與通過的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上激光 空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列 Innova70系列第7頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測信號第8頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月散射光信號—前向散射光(FS)FSForward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器

FS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關(guān)FS用于檢測細(xì)胞或其他粒子的表面屬性 如:大小第9頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月前向散射光第10頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月散射光信號–側(cè)向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器,也稱為90度散射光檢測器

SS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關(guān)SS用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比第11頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月側(cè)向散射光第12頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月90DegreeScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale第13頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月光路-熒光信號每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長,并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細(xì)胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長.利用各種不同波長的光學(xué)濾片來收集(檢測)這些光學(xué)信號第14頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)第15頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670第19頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月光路-濾片特性當(dāng)以45o

角放置濾片時(shí),該濾片可以通過一定波長的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長以下的光

這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)

第20頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月SourcelightPassedlightCertaincolorsabsorbedAbsorbancefilter第21頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)帶通濾片bandpass光源通過的光譜630/30nmBP615-645nmlight

第22頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月Unique4-ColorSingleLaserDesignAir-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL第23頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月PC7Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)675BP(PC5)750BPFL4(PC7)488DL488BK550DL600DL700DL第24頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月Optics-DetectorsPhotomultipliertube(PMT)

將光學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號

第25頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月不同的脈沖信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程

第26頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月SingleParameterHistogram:CountvsMFI第27頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月顏色補(bǔ)償各熒光染料發(fā)射的熒光信號有重迭,因此要進(jìn)行色補(bǔ)償以除去重迭部分?第28頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月emissionintensitywavelengthFLBFLA光譜重疊需進(jìn)行色補(bǔ)償?shù)?9頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月減法顏色補(bǔ)償減法補(bǔ)償去除疊加信號,在使用雙色以上時(shí)會產(chǎn)生減得過多的錯(cuò)誤BDFACSCalibur補(bǔ)償試劑FITCPECorrectOver-compFITCPEUnder-compFITCPE第30頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月全矩陣顏色補(bǔ)償全矩陣在每個(gè)PMT上對于每一個(gè)熒光計(jì)算“疊加熒光素”的比率通過矩陣去除或加上信號EPICSXLCytomicsFC500CD45-ECD第31頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月EPICSXL臨床科研型流式細(xì)胞儀第32頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

EPICSXL合理的光路設(shè)計(jì)單激光激發(fā)四色熒光標(biāo)準(zhǔn)模式確保在同一個(gè)細(xì)胞上獲得最多的信息第33頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月EPICSXL直線光路設(shè)計(jì)，光損失少可互換式光學(xué)濾片，方便新染料的應(yīng)用Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL第34頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)675BP(PC5)750BPFL4(PC7)488DL488BK550DL600DL700DLPC7第35頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月WithThankstoDr.FrankSchniedersGentherapieGruppe–AbteilungMolekulareZellbiologieInstitutfürMedizinischeBiochemieundMolekularbiologieUniversit?tsklinikumHamburg-EppendorfEGFP,EYFPand7-AADWithEPICS?XLTMandEXPO32TMADC-SoftwareHEK293HumanEmbryonalKidneyCells293FilterSetBP510LAF21BP550LAF30DichroicMirror525DRLPCellViabilitywith7-AADHEK293-cellswithEYFPTransfectionHEK293-cellswithEGFPTransfectionMixtureofEGFP-andEYFP-transfectedHEK293-CellsEGFP...EnhancedGreenFluorescentProtein(Ex488;Em507nm)EYFP...EnhancedYellowFluorescentProtein(Ex513;Em527nm)7-AAD...7-Aminoactinomycin(ViabilityStain;Ex546;Em647nm)第37頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月四色熒光中的補(bǔ)償?shù)?8頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月傳統(tǒng)補(bǔ)償與ADC補(bǔ)償?shù)?9頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月EPICSXL采用最先進(jìn)的通訊傳輸設(shè)計(jì)光纖通訊與數(shù)字信號傳輸?shù)?0頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月EPICSXL中的PRISM功能

將多張直方圖濃縮在一張上第41頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月HowardM.Shapiro,PracticalFlowCytometry,3rded.,page355“TheXLispresentlyuniqueamongproductionflowcytometerinitsuseofdigitalelectronicsfortransformationbetweenlinearandlogarithmicsignalsandofcomputeralgorithmforfluorescencecompensation.Ihavealreadypraisedthisapproachafewtimes(pp.19,166,189),whilealsonothingthatitprobablyrepresentedtheonlypracticalwaytoimplementanotherfeaturewhichpresentlydistinguishestheEPICSXLfromit’scompetitors,i.e.,4-colorfluorescenceanalysis.Bothfeatureswillhavetheothermanufacturerstryingtoplaycatch-upforawhile.”“XL因?yàn)橛腥珨?shù)字化的線性-數(shù)轉(zhuǎn)換及電腦軟體螢光補(bǔ)償而成為現(xiàn)今流式細(xì)胞分析儀系統(tǒng)中最獨(dú)特的產(chǎn)品.個(gè)人也多次表示欽佩(第19,166,189頁).EPICSXL(單一激光產(chǎn)生)的四個(gè)螢光分析性能,使其鶴立於其他競爭者之中.這些功能將會讓其他廠商花很長的時(shí)間來追趕”.摘自”流式細(xì)胞分析儀系統(tǒng)實(shí)務(wù)第三版,1995.”作者HowardM.Shapiro,PracticalFlowCytometry,3rded.,page355專家評述第42頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月來自ISAC的報(bào)告第43頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)品介紹

XL設(shè)計(jì)的所有優(yōu)勢：單激光激發(fā)四色熒光光纖通訊數(shù)字化信號傳遞可互換式光學(xué)濾片，無需調(diào)整光路具有620nm的濾片,最適合DNA倍體分析利用軟件進(jìn)行全矩陣優(yōu)化（ADC)顏色補(bǔ)償PRISM濃縮柱形圖快速調(diào)節(jié)電壓快速調(diào)整補(bǔ)償補(bǔ)償向?qū)Ю蒙飿颖具M(jìn)行顏色補(bǔ)償WINDOWS界面操作軟件第44頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月Cytomics?FC500第45頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月MCL進(jìn)樣MCL自動模式.MCL直接(

或手動)

模式.單管固定位置進(jìn)樣.可以暫停/旋轉(zhuǎn)以方便隨時(shí)添加刺激劑等條碼識別樣本混勻產(chǎn)品介紹：硬件第46頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)品介紹：硬件可選MPL(研究用)24孔每孔樣本體積0.5–2.5ml96孔最少體積200ul40管(12x75mm)最