毛葉疏花薔薇果提取物的遺傳毒性研究

野生玫瑰是薔薇科的一種落葉小型灌木。通常生長在路邊、場地或丘陵上，果實會形成。人工種植的玫瑰主要用于觀賞，但果實很少。近年來的研究1材料和方法1.1體外代謝活化系統(tǒng)野生薔薇果于2013年9月采集于新疆阿爾泰山區(qū),經(jīng)本院天然藥物化學教研組鑒定為薔薇科宿萼大葉系毛葉疏花薔薇的新鮮果實。提取物的制備體外代謝活化系統(tǒng)S9(批號3239),上海寶錄生物科技有限公司;環(huán)磷酰胺(批號20121103),山西普德藥業(yè)公司;小牛血清(批號131007),浙江天杭生物科技有限公司;9-芴酮(9-fluorenone,批號1166),美國AldrichChem公司;疊氮鈉(NaN1.2恒溫-toldo公司BBS-SSC超凈工作臺,濟南博鑫生物技術(shù)有限公司;FlashGo菌落計數(shù)儀,西班牙IUL公司;AJ100萬分之一電子天平,瑞士Mettler-Toledo公司;MaxQ420HP恒溫搖床,美國Thermo公司;GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司;SX-500全自動高壓滅菌器,日本Tomy公司;BX51T系統(tǒng)熒光顯微鏡,日本Olympus公司;R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士Büchi公司;真空冷凍干燥機,美國LABCONCO公司;電泳儀,美國Bio-Rad公司;凝膠電泳成像分析系統(tǒng),美國AlphaInnotech公司等。1.3實驗動物使用許可證號SPF級SD大鼠和KM種小鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2009-0004,實驗動物使用許可證號為SYXK(湘)2012-0005。TA97、TA98、TA100和TA102標準測試菌株由江蘇省疾控中心提供。1.4急性口腔毒性試驗采用最大耐受量法1.5大鼠傷寒沙桿菌回復突變實驗pmes實驗采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100和TA102等4株菌株,按平板摻入法進行實驗1.6大鼠骨髓疾病樣紅細胞微微核測量采用30h2次給藥法1.7小鼠經(jīng)口微核試驗取體質(zhì)量25~35g的雄性小鼠,每組5只動物進行實驗。組別、劑量設計和結(jié)果判定同微核實驗,新鮮配成相應的受試液給小鼠灌胃,連續(xù)染毒5d,1次/d,于首次染毒后第35天處死動物,取副睪于生理鹽水中剪開靜置,4層擦鏡紙濾過后涂片,甲醇固定,1%伊紅染色。光學顯微鏡下,每只動物計數(shù)1000個結(jié)構(gòu)完整的精子,計算畸變精子發(fā)生率1.8骨髓細胞系統(tǒng)的調(diào)整微核實驗中動物胸骨取材后,同時取股骨去兩端用冰冷適量磷酸鹽緩沖液(PBS,臨用前加10%的DMSO)沖洗骨髓腔,制成單細胞懸液,顯微鏡下調(diào)整細胞密度至101.9統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)用ue0af±s表示,采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1大鼠的體質(zhì)量變化以15.0和20.0g/kg劑量的毛葉疏花薔薇果提取物分別給兩種性別的大、小鼠灌胃后,出現(xiàn)活動減少、腹瀉現(xiàn)象,第3天基本恢復正常,觀察期14d內(nèi)無死亡,動物體質(zhì)量增長均在正常值范圍內(nèi),且與對照動物比較,第7天和實驗末的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。觀察期結(jié)束后對所有動物主要臟器做大體解剖觀察,未見明顯異常改變。2.2受試藥物對ta97、ta98、ta80、ta80、ta80、ta802回復突變ames由表1和表2可見,正式實驗中,在80~50000mg/L劑量水平,受試藥物對TA97、TA98、TA100和TA102等4株實驗菌株,加與不加S9,平行條件下實驗2次,回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍,亦無劑量效應關(guān)系。2.3pce不同時點對pce的影響由表2可見,各劑量組的PCE/NCE比值均在本室正常值范圍(0.9~1.2)內(nèi),且不少于對照組的20%,表明受試物濃度設置合理,PCE的形成沒有受到抑制。與空白對照組〔雄性小鼠微核率為(1.0±1.0)‰,雌性為(0.8±0.4)‰〕比較,受試藥物各劑量組微核率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而環(huán)磷酰胺組雄性達到(29.0±3.9)‰,雌性達到(25.6±4.0)‰,差異顯著有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。2.4畸形率比較由表3可見,與空白對照組畸形率為(1.98±0.16)%,與空白對照組比較,受試藥物各劑量組精子畸形發(fā)生率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),而環(huán)磷酰胺組畸形率達(10.48±1.07)%,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。此外,根據(jù)GB15193.7-2003中小鼠精子畸形分類標準(精子畸形主要表現(xiàn)在頭部,其次為尾部,可分為無鉤、香蕉形、胖頭、無定形、尾折疊、雙頭、雙尾等),對精子畸形構(gòu)成比進行統(tǒng)計,結(jié)果提示精子畸形構(gòu)成比本底值穩(wěn)定,結(jié)果真實可信。2.5不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠拖尾率和尾dna含量的影響由表4可見,空白對照組雄性小鼠的拖尾率和尾部DNA含量分別為(2.80±1.57)%和(9.02±1.88)%,雌性分別為(4.40±0.79)%和(9.41±1.79)%;與空白對照組比較,受試藥物各劑量組的彗星拖尾率和尾部DNA含量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而環(huán)磷酰胺組雄性小鼠的拖尾率和尾部DNA含量分別達到(44.80±8.85)%和(38.21±8.13)%;雌性分別達到(38.80±11.56)%和(33.15±6.52)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。3毛葉疏花牡丹花果提取物對大、小鼠的致突變性天然植物富含多種活性成分,黃酮類化合物就是其中的一大類。野生薔薇果中富含大量維生素和黃酮類化合物急性毒性實驗是評價藥物安全性的一項重要基礎(chǔ)指標。實驗中采用最大耐受量法在短時間內(nèi)給動物大劑量染毒,觀察動物的反應。研究中,累積灌胃最大劑量分別達到15.0和20.0g/kg,大、小鼠均未出現(xiàn)死亡情況,除了剛開始灌胃后第1天內(nèi)動物活動減少和腹瀉,之后生長良好。探究原因可能是大劑量受試物短時間內(nèi)刺激動物腸胃,使其不適。實驗末剖檢存活動物,主要臟器均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病變。提示在本實驗室條件下,短期內(nèi)毛葉疏花薔薇果提取物對大、小鼠是安全的,