人類輔助生殖技術(shù)生產(chǎn)用水的質(zhì)量控制

0輔助生殖用液的質(zhì)量現(xiàn)代人類生活環(huán)境、工作和社會(huì)壓力等因素導(dǎo)致了妊娠和不育的發(fā)病率。最新《中國(guó)不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報(bào)告》顯示，中國(guó)的不孕不育率從20年前的2.5%至3%攀升到12.5%至15%左右，患者人數(shù)超過4000萬(wàn)，即每8對(duì)夫婦中就有1對(duì)有不孕不育問題。其中約20%需要通過輔助生殖技術(shù)（assistedreproductivetechnology,ART）來(lái)治療。輔助生殖用液的質(zhì)量直接關(guān)系到ART的成功率，其成分配方及生產(chǎn)工藝決定了這類產(chǎn)品的質(zhì)量。目前市場(chǎng)上的輔助生殖用液種類繁多，涉及到了ART的各個(gè)具體過程，包括配子收集處理、體外受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎凍存復(fù)蘇以及胚胎活檢，甚至ART儀器設(shè)備的清洗等等。絕大多數(shù)以水作溶劑且占整個(gè)液體成分比例的90%以上，所以水的品質(zhì)是影響ART用液質(zhì)量的最主要因素之一水為輔助生殖用液的主要成分，在制備純化水時(shí)，去除水中的污染物至關(guān)重要本研究選取通過MilliQ系統(tǒng)制備的三種純化水，包括去離子反滲透水、超純化水及無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的超純化水，通過鼠胚試驗(yàn)測(cè)試了它們的胚胎毒性，結(jié)果證明使用無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的超純化水制備的輔助生殖用液產(chǎn)品的鼠胚發(fā)育效果最好，囊胚總細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)顯著高于其他三組，本研究證明了用于制備輔助生殖用液類產(chǎn)品的水，去除其中內(nèi)毒素和核酸成分的重要性，為輔助生殖用液的水質(zhì)選擇提供依據(jù)。1試驗(yàn)材料和方法1.1儲(chǔ)采用反滲透膜與ro膜柱取水環(huán)境：十萬(wàn)級(jí)凈化車間。自來(lái)水（A）：符合生活用水標(biāo)準(zhǔn)的位于江蘇省南京市江北新區(qū)自來(lái)水。去離子反滲透水（B）：將自來(lái)水先后經(jīng)過棉芯柱、活性炭柱，進(jìn)入MilliQ純化系統(tǒng)（MERCK,CHINA）中，再通過ProgardT3柱、RO膜和254nm紫外照射進(jìn)入儲(chǔ)水桶制成去離子反滲透性水（deionizedreverseosmosis,DRO）。超純水（C）：去離子反滲透水從儲(chǔ)水桶中再進(jìn)入MilliQ純化系統(tǒng)（MERCK,CHINA）經(jīng)過185nm紫外照射、Q-Park柱以及濾過系統(tǒng)（Millipak無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的超純水（D):MilliQ超純化水經(jīng)過超濾系統(tǒng)（BioPakultrafiltration）處理制備成無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的MilliQ超純化水。1.2材料的選擇利用以上四種水各配制一套鼠胚試驗(yàn)用液，包括卵母細(xì)胞緩沖液、顆粒細(xì)胞去除液和胚胎培養(yǎng)液。所有的原材料購(gòu)于MERCK。卵母細(xì)胞緩沖液是含有0.3%BSA，以HEPES為緩沖體系的HEPES-HTF1.3大鼠育種試驗(yàn)鼠胚試驗(yàn)的基本流程簡(jiǎn)述如下1.4囊壁總細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞的染色和計(jì)數(shù)利用免疫熒光試劑盒（南京優(yōu)而生物）實(shí)施囊胚總細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的染色和計(jì)數(shù)1.5囊胚形成率、細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析囊胚形成率是以擴(kuò)張優(yōu)質(zhì)囊胚占全部受精卵的百分比。三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)囊胚形成率、囊胚總細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)各組間的差異性通過t-test分析，P值表示了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異性。2不同種水對(duì)體外小鼠精子囊胚形成率和細(xì)胞數(shù)的影響鼠胚試驗(yàn)（mouseembryoassay,MEA）可以作為水質(zhì)的質(zhì)控檢測(cè)手段結(jié)果顯示CBA/C57F1雜交小鼠的受精卵在自來(lái)水(A)和去離子水(B)配制的培養(yǎng)液不能達(dá)到基本的MEA要求（表1）（圖1(A)和(B)），有22.2%左右的受精卵在用自來(lái)水配制的培養(yǎng)液中也能發(fā)育到囊胚，但囊胚細(xì)胞數(shù)（20.1±0.82）和ICM數(shù)（3.4±0.23）非常少，并且細(xì)胞形態(tài)明顯異常。用去離子水（B）配制的培養(yǎng)液能使62.2%受精發(fā)育到囊胚，但囊胚總細(xì)胞數(shù)（32.2±0.64）及ICM的細(xì)胞數(shù)（6.7±0.45）分別不能達(dá)到正常囊胚的要求。相比之下，MilliQ超純化水（C）和無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的MilliQ超純化水（D）（表1）（圖1(C)和(D)）含低水平的無(wú)機(jī)離子、總有機(jī)碳和內(nèi)毒素濃度，用MilliQ超純化水（C）和無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的MilliQ超純化水（D）制備的輔助生殖用液培養(yǎng)囊胚的囊胚形成率分別為84.4%和86.7%，囊胚總細(xì)胞數(shù)分別為53.4±0.45和56.6±0.52，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分別為12.4±0.32和14.1±0.20，達(dá)到要求，其鼠胚試驗(yàn)的結(jié)果的三項(xiàng)指標(biāo)都比A和B組更好（P值均<0.001），當(dāng)然，在MilliQ超純化水的基礎(chǔ)上經(jīng)過超濾系統(tǒng)（BioPakultrafiltration）處理制備的無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的MilliQ超純化水（D）的MEA結(jié)果更佳，表現(xiàn)為更多的囊胚總細(xì)胞數(shù)（P<0.05）和ICM細(xì)胞數(shù)（P<0.05）。不同種水對(duì)體外小鼠受精卵囊胚形成率和細(xì)胞數(shù)的影響，如表1、圖1所示。綜合以上研究結(jié)果證明使用無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的超純化水制備的輔助生殖用液產(chǎn)品的鼠胚發(fā)育效果最好，囊胚總細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)顯著高于其他三組，也證明了去除內(nèi)毒素和去除核酸物質(zhì)的處理對(duì)于輔助生殖用液類產(chǎn)品生產(chǎn)用水的重要性。3輔助生殖產(chǎn)品用水的質(zhì)控策略水是輔助生殖用液類產(chǎn)品的主要組成成分，許多研究人員研究了水質(zhì)對(duì)動(dòng)物胚胎發(fā)育的影響通過本研究，分析四種純化水的鼠胚試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超純化水和無(wú)內(nèi)毒素?zé)o核酸的超純化水配制的胚胎培養(yǎng)液，其鼠胚試驗(yàn)的囊胚形成率和囊胚總細(xì)胞數(shù)及內(nèi)外細(xì)胞團(tuán)數(shù)目的結(jié)果均令人滿意。值得注意的是，由于各國(guó)，甚至同一個(gè)國(guó)家不同地區(qū)的水的質(zhì)量不同，在建立ART用水制備生產(chǎn)工藝時(shí)必須因地制宜，特別在國(guó)產(chǎn)化的過程中，更要考慮到各種因素，如環(huán)境、地質(zhì)及污染等等。要盡可能避免內(nèi)毒素和核酸的污染。影響輔助生殖用液質(zhì)量的關(guān)鍵因素包括了多個(gè)方面。細(xì)菌污染及其副產(chǎn)品是用水質(zhì)量最主要關(guān)注的因素。多種技術(shù)已經(jīng)可以最大限度地減少水中細(xì)菌的含量，如反滲透，0.22μm過濾器過濾和紫外線照射。在純水貯存過程中也可能發(fā)生細(xì)菌污染。因此，在執(zhí)行ART流程時(shí)，最可取的是使用新鮮的純化水。另一個(gè)重要因素是離子和重