馬立克氏病病毒的分離與初步鑒定

馬麗斯病毒素（mdv）是馬拉米星病毒素的成員，可能是雞腫瘤。MD是一種可用疫苗預(yù)防的病毒性腫瘤病,自MDV首次分離以來1材料和方法1.1sdau132臨床表現(xiàn)SDAU1501是在105日齡左右已免疫CVI988疫苗的白羽肉種雞分離,臨床表現(xiàn)為肝臟有腫瘤;SDAU1502是在110日齡左右已免疫CVI988疫苗的白羽肉種雞分離,臨床表現(xiàn)為心臟有腫瘤;SDAU1503是在120日齡左右已免疫814疫苗的白羽肉種雞分離,臨床表現(xiàn)為肝臟有腫瘤。1.2引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上的MDV參考強(qiáng)毒株及超強(qiáng)毒株序列,分別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增meq、pp38、vIL8基因的上、下游引物,引物委托上海生物工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物測(cè)序委托北京華大基因完成。1.3細(xì)胞分離和細(xì)胞接種無(wú)菌采集病雞抗凝血0.8mL,用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞,接種120μL至長(zhǎng)滿單層次代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的6孔板中,37℃,5%CO1.4細(xì)胞病變后ba4單抗將感染病毒的CEF細(xì)胞接種于24孔板上,待出現(xiàn)細(xì)胞病變后,用PBS洗3遍后用丙酮乙醇(3∶2)固定8~10min,然后分別用BA4單抗1.5rtaq酶活動(dòng)力學(xué)pcr從感染病毒的CEF細(xì)胞中提取病毒基因組作為模板,分別用1.2設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增與病毒致病有關(guān)的基因meq、pp38和vIL8。50μLPCR反應(yīng)體系:10×PCRBuffer5μL,dNTP4μL,上、下游引物各1μL,rTaq酶1μL,DNA模板1μL,最后加雙蒸水至總體積50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃5min;95℃30s,55℃30s,72℃1min(31個(gè)循環(huán));72℃再延伸10min,4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后,送北京華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAS-tar軟件和MEGA軟件處理并與GenBank上其他MDV參考毒株的序列進(jìn)行比較分析。2結(jié)果2.1雞自愿性病:主要表現(xiàn)為外受精神不穩(wěn)，出現(xiàn)紅色囊包的情況,主要是受精3個(gè)雞場(chǎng)的病雞群初期發(fā)現(xiàn)有消瘦雞只,精神沉郁,食欲減退,多數(shù)發(fā)病雞出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,主要表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn),共濟(jì)失調(diào);部分發(fā)病雞在趾叉部位出現(xiàn)紅色囊包,包內(nèi)有積液,破潰后結(jié)痂。在發(fā)病高峰期時(shí),幾乎所有病雞剖檢可見肝臟、心臟出現(xiàn)綠豆粒大小的腫瘤,病理切片顯示了大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。發(fā)病雞幾乎全部為母雞,公雞未見。2.2mdv蝕斑的檢測(cè)分別將3個(gè)雞場(chǎng)病雞中分離的淋巴細(xì)胞分別接種原代CEF細(xì)胞,5d后未出現(xiàn)細(xì)胞病變,盲傳至第3,4代出現(xiàn)典型MDV蝕斑,并分別命名為SDAU1501,SDAU1502和SDAU1503。然后,分別用抗MDV血清Ⅰ型特異性單克隆抗體BA4和鑒別MDV野毒株的單克隆抗體H19進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),在倒置熒光顯微鏡下可清晰地看到亮綠色的病毒蝕斑(圖2),證明所分離的3株病毒為MDV血清Ⅰ型,且為野毒株。2.3相關(guān)致病基因檢測(cè)為了更全面的了解3株病毒的特點(diǎn),我們分別從感染的CEF細(xì)胞中擴(kuò)增了MDV的相關(guān)致病基因meq、pp38和vIL8基因,電泳結(jié)果顯示,meq基因長(zhǎng)約1020bp,pp38基因長(zhǎng)約820bp,vIL8基因長(zhǎng)約650bp,均與預(yù)期目的片段大小相符(圖3)。2.4同源性和氨基酸序列分析分別將3株MDV的meq、pp38和vIL8基因與標(biāo)準(zhǔn)參考毒株進(jìn)行氨基酸序列比較分析,發(fā)現(xiàn)SDAU1503株與CVI988和814株在同一分支上,而SDAU1502和SDAU1501在另外同一分支上,與中國(guó)早期分離的GX0101距離較近(圖4)。同源性分析發(fā)現(xiàn)SDAU1503meq基因與CVI988同源性最高為99.1%,而SDAU1502與SDAU1501同源性為100%,且與GX0101相同;pp38基因相對(duì)保守,SDAU1503和SDAU1502與GX0101序列完全一致,而SDAU1501與GX0101的同源性為99.7%,與其他國(guó)外參考毒株的同源性也高達(dá)99.3%;vIL8基因SDAU1503與4個(gè)國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性最高為99.3%,而SDAU1502和SDAU1501與GX0101同源性最高,分別為98.5和99.3%,與國(guó)外參考毒株的同源性為97%。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)3株MDV的meq基因在第71位氨基酸與其他標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株均為A,而CVI988和814株在該點(diǎn)均為S;其次是SDAU1501和SDAU1502在第80,115,139和176位的氨基酸與GX0101具有相同的突變(D80Y,V115A,T139A,P176R),而SDAU1503在第194位有一個(gè)與CVI988相同的氨基酸缺失(P)(表2)。在pp38基因3種MDV毒株均出現(xiàn)了與GX0101一樣的突變(表2);在vIL8基因SDAU1501和SDAU1502在第4,31位出現(xiàn)了與GX0101相同的變化(L4S,D31G),但SDAU1502在第93位出現(xiàn)了特有的氨基酸突變(E93V),其他參考毒株均無(wú)此類突變(表2)。3關(guān)meq在mdv細(xì)胞毒性檢測(cè)中的作用近年來,MD在產(chǎn)蛋雞群中的暴發(fā)在印度、日本均有報(bào)道pp38基因編碼的是一個(gè)38000的磷蛋白,與病毒從潛伏期重新激活以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)化相關(guān)Meq是一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈蛋白(bZIP),可與自身或cJun、JunB及Fos等形成二聚體,通過反式激活作用促進(jìn)一些基因的表達(dá),從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化vIL8